Cfhr1基因型、高密度脂蛋白上cfhr1及氧化磷酸膽堿的測定試劑盒及測定方法

專利名稱：Cfhr1基因型、高密度脂蛋白上cfhr1及氧化磷酸膽堿的測定試劑盒及測定方法
技術領域：
本發明涉及補體因子H相關蛋白I (CFHRl)的基因型鑒定，CFHRl在血漿中的測定方法，含CFHRl高密度脂蛋白樣顆粒的分離純化，CFHRl對氧化特異性抗原的結合，以及高密度脂蛋白(HDL)上氧化磷脂的檢測，并且通過以上檢測所得到的數據，對年齡相關性黃斑變性進行預警性診斷和治療指導。具體涉及有關的定量檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
年齡相關性黃斑變性(AMD)的發病機理涉個體的遺傳變異及環境危險因素(如氧化應激)的相互作用。AMD患者視力的嚴重損失大多是由于脈絡膜新生血管(CNV)出血及滲出，或濕性AMD引起。AMD是老年人不可逆失明的主要原因并影響世界上數以百萬的人。
全基因組關聯研究(GWAS)可有效推進基于分子水平的復雜性狀疾病1的研究。但是，對遺傳變異的性狀與發病機制之間的理解仍需實質性的突破。現已發現AMD的發生與 I號染色體上的補體因子H (CFH)區域密切相關。CFH區域包含兩個主要疾病風險單體，一個由rsl061170 (Y402H)標記，另一個由rs227470(T9標記。這兩個風險單體型一起出現在60%以上的AMD患者中。
最近的研究發現，CFH相關蛋白(CFHRs)的拷貝數變異也與AMD相關。特別是，由 rs6677604標記的CFHRl在高密度脂蛋白上的缺失與避免AMD1tu2病變有關。CFHRl基因位于I號染色體長臂31-32區域，其蛋白編碼與CFH的C端具有高度同源性。CFHRs與補體系統中的其它具體效應因子相互結合起調節功能。
研究表明，許多老化疾病與氧化應激相關，包括動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏病和 AMD1m90除了全身整體性的氧化應激，視網膜感光細胞同時還因為與局部氧化產物的接觸所受到氧化應激。視網膜的感光細胞含有大量不飽和脂肪酸磷脂，如磷脂酰膽堿(PtC)等。 這些磷脂是極容易受到氧化應激導致化學結構發生變化，產生各種氧化磷脂(oxPLs)。例如 l-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PAPC, I-掠櫚酉先 ~2~ 花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿)是最常見視網膜磷脂之一。在氧化作用下，其中的雙鍵結構被打斷，從而使磷酸膽堿(PC)基團產生構象變化，變為l-palmitoyl_2-(5’ -oxo-valeroyl )-snglycero-3-phosphocholine(POVPC, I-棕櫚酰 _2_ 氧化戍酰 _sn_ 甘油-3-磷酸膽堿) (圖I)。POVPC可以由鼠天然抗體TEPC15 (通常也叫T15)明確識別。相比之下，TEPC-15卻不與正常細胞膜或天然脂蛋白上的非氧化卵磷脂結合20。通常，oxPLs存在于氧化修飾的低密度脂蛋白(oxLDL)載體或凋亡細胞上。很多研究已經表明oxPL能夠刺激強烈的炎癥反應，并且可以作為一個可靠的氧化應激生物標記物21’22。
有研究人員發現，一部分的CFHRl存在于血漿中一種特殊的高密度脂蛋白樣顆粒上。該顆粒包含載脂蛋白A (ΑροΑΙ)、脂多糖結合蛋白(LBP)和磷脂23。由于此高密度脂蛋白樣顆粒僅占小于HDL總量的1%，因此推測它不是脂質轉運的結構組件。相反，它可能具有調節功能，可能是參與和細菌內毒素的結合來調節炎癥反應。然而，CFHRl在此高密度脂蛋白樣顆粒中的確切作用尚沒有被充分探討，尤其是在AMD的研究中。
研究者已經在AMD患者的視網膜玻璃膜疣和Bruch膜中檢測到了被氧化修飾的蛋白質和脂24。作為天然防御機制的一部分，CFHRs可能參與這種氧化應激的調節。有報道稱CFHRl缺失(CFHRl Δ )對于AMD風險有保護作用1CU1。但是，其對于AMD風險的影響機制在很大程度上還是未知的。發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物對。
本發明的技術方案是用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物對，包括標記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座CFHRl擴增引物對
上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3 ’( SEQ ID No 1)
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
在此基礎上，本發明還提供了用于對標記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座進行基因型鑒定的引物，其核苷酸序列
5’-TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。該引物主要是將上述CFHRl擴增引物對的擴增產物進行測序，以測得CFHRl上標記為rs6677604的 SNP基因座的序列，進而得到樣本的基因型。
本發明要解決的一個技術問題是提供一種用于鑒定人組織樣本DNA中補體因子H 相關蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒，該試劑盒包含下列成分
a、從人組織樣本中提取DNA模板的試劑；
b、用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物，包括擴增標記為rs6677604的 CFHRl擴增引物對
上游引物:5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQID No 1)
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
C、用于對DNA擴增產物的片斷進行基因型鑒定的引物序列，包括標記為 rs6677604的CFHRl基因型鑒定的引物序列
5， -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。
其中，上述試劑盒中所述的人組織樣本為外周血樣本。
本發明提供的標記為rs6677604的CFHRl擴增引物對可應用于制備鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒。
本發明提供的標記為rs6677604的CFHRl基因型鑒定的引物可應用于制備鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒。
本發明提供的鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒可用于檢測年齡相關性黃斑變性(AMD)患者CFHRl基因型。
本發明還提供了一種鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白1 (CFHRl)基因型的方法，該方法包括以下步驟
a、從人組織樣本中提取和純化DNA模板；
b、利用DNA模板擴增補體因子H相關蛋白1 (CFHR1)基因片段，采用的擴增引物為rs6677604標記的CFHRl擴增引物對
上游引物5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQID No I)；
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
C、使用基因型鑒定的引物序列對步驟b得到的補體因子H的基因片段進行擴增， 得到的產物測序進行基因型SNP鑒定，如果其中保護性等位基因為純合子標記為AA ;其中如果致病性等位基因為純合子標記為GG ;其中如果保護性/致病性等位基因為雜合子標記為AG。
其中所述的基因型鑒定的引物為 5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAA TGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。
本發明還提供了一種測定血漿中CFHRl含量的免疫印跡試劑盒，該試劑盒包含下列成分
a、抗 CFHRl 的抗體；
b、CFHRI 標準品。
其中用于制備抗CFHRl抗體的多肽為CPTVQNAHILSRQMS (SEQ ID No 4)。
其中所述抗CFHRl的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區片段中的任一種。
本發明還提供了測定血漿中CFHRl含量的方法，包括以下步驟
a、將血漿樣本進行SDS電泳；
b、將電泳分離后的膠轉印至尼龍薄膜；
C、使抗CFHRl抗體與薄膜上的蛋白結合；
d、測定所述抗體與CFHRl的結合量。
其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學發光免疫分析法、酶聯免疫吸附試驗法、生物素一親和素系統測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來檢測所述抗體與 CFHRl的結合量。
其中，上述方法中還可包括步驟e，即根據以CFHRl標準品測得的標準曲線，測定血漿中的CFHRl量。
本發明還提供一種從血漿中分離純化含CFHRl的高密度脂蛋白的試劑盒，該試劑盒包含下列成分溴化鉀，比重計，離心管和透析膜。
本發明還提供一種從血漿中分離純化含CFHRl的高密度脂蛋白的方法，該方法包括以下步驟
a、將外周血進行血漿分離
b、用溴化鉀將血漿調整至I. 027克/毫升
c,45,000RPM 離心 18 小時
d、丟棄上層液后，提取中層液體
e、用溴化鉀將其調整至I. 065克/毫升
f、45，000RPM 離心 18 小時
g、上層液體，放入透析袋；
h、用PBS透析后測定蛋白濃度
本發明還提供了一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結合量的試劑盒，該試劑盒包含下列成分
a、抗載脂蛋白Al抗體，用于將血漿中高密度脂蛋白樣顆粒俘獲；
b、抗CFHRl的抗體，用于與含高密度脂蛋白樣顆粒的樣品接觸。
其中用于制備抗CFHRl抗體的多肽序列為CPTVQNAHILSRQMS (SEQ ID No 4)。
其中所述抗CFHRl的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區片段中的任一種。
本發明同時提供了一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結合量的方法，包括以下步驟
a、用抗載脂蛋白Al抗體將血漿中高密度脂蛋白俘獲；
b、將抗CFHRl的抗體與含高密度脂蛋白樣顆粒的樣品接觸；
C、使抗CFHRl的抗體與其中的CFHRl結合；
d、測定抗CFHRl的抗體與CFHRl的結合量。
其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學發光免疫分析法、酶聯免疫吸附試驗法、生物素一親和素系統測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來檢測所述抗體與 CFHRl的結合量。
為了使檢測結果更為準確，可以通過使用純化的CFHRl標準品與抗CFHRl的抗體制備得到標準曲線，然后通過標準曲線來獲得待測樣品中高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結合量。因此，上述方法中還可包括步驟e，即根據以CFHRl標準品測得的標準曲線，測定氧化高密度脂蛋白樣顆粒表面的CFHRl量。
本發明提供了一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的試劑盒，該試劑盒包含下列成分
a、抗載脂蛋白Al抗體，用于將血漿中高密度脂蛋白樣顆粒俘獲；
b、抗磷酸膽堿的抗體，用于與含高密度脂蛋白樣顆粒的樣品接觸。
其中，上述試劑盒中所述抗磷酸膽堿的抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區和V-kappa 22VL輕鏈可變區。
本發明同時提供了一種定量檢測含高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的方法，包括以下步驟
a、用抗載脂蛋白Al抗體將血漿中高密度脂蛋白俘獲；
b、將抗磷酸膽堿的抗體與高密度脂蛋白的樣品接觸；
C、使所述抗磷酸膽堿的抗體與氧化磷酸膽堿結合；
d、測定所述抗磷酸膽堿的抗體與氧化磷酸膽堿的結合量。
其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學發光免疫分析法、酶聯免疫吸附試驗法、生物素一親和素系統測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來檢測所述抗體與氧化磷酸膽堿的結合量。
其中，上述方法還可包括步驟e，即根據以磷酸膽堿化合物為標準品測得的標準曲線，測定氧化高密度脂蛋白表面的氧化特異抗原決定簇的量。
其中，上述方法中所述的抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區和V-kappa 22VL輕鏈可變區。
其中，上述方法中所述的含有氧化高密度脂蛋白樣品為血清、血漿、組織勻漿液或組織提取液。
本發明還提供一種定量測定補體因子H相關蛋白I與氧化特異性抗原結合的試劑盒，該試劑盒含有下列成分
a、含POVPC的氧化特異性抗原；
b、抗 CFHRl 的抗體。
本發明同時提供一種定量測定補體因子H相關蛋白I與氧化特異性抗原結合的方法，包含下列操作步驟
a、制備含POVPC的氧化特異性抗原；
b、包被氧化特異性抗原在微孔板上；
C、將血漿中CFHRl與氧化特異性抗原結合；
d、用抗CFHRl的抗體測定CFHRl與氧化特異性抗原的結合量。
其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學發光免疫分析法、酶聯免疫吸附試驗法、生物素一親和素系統測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來檢測所述CFHRl與氧化特異性抗原的結合量。
其中，上述方法還可包括步驟e，即根據以CFHRl為標準品測得的標準曲線，測定 CFHRl與氧化特異性抗原的結合量。
本發明中CFHRl標準品可采用以下方式獲得將CFHRl重組質粒轉染真核生物體外表達系統，該質粒表達后，然后通過親和層析純化得到CFHRl標準品。
本發明中外周血基因組DNA的提取與純化，可以通過本領域熟知的生物工程方法制備，可使用Qiagen公司的血液DNA純化試劑盒。
在本發明的定量檢測含高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的方法中，所述抗載脂蛋白Al抗體和抗磷酸膽堿的抗體可從市場上購買也可通過本領域熟知的生物工程方法制備。例如，購自Sigma化學公司的抗人體ApoAI抗體Anti-humanApoAI(HDL)和TEPC15 即可用做本發明方法中的抗體。此外，可以用常規免疫學方法制備抗載脂蛋白Al抗體(即用純化人載脂蛋白B注射山羊制備抗血清純化IgG的方法)，或者用生物工程方法制備抗磷酸膽堿的抗體，優選編碼所述抗磷酸膽堿的抗體的基因含有S107VH重鏈可變區和V-kappa 22VL輕鏈可變區。在檢測過程中，為了使檢測結果更為準確，可以通過不同量的磷酸膽堿化合物標準品與抗磷酸膽堿的抗體的結合獲得標準曲線，測定氧化高密度脂蛋白表面的氧化特異抗原決定簇的量。
在本發明中“磷酸膽堿”(Phosphocholine)指的是磷脂酰膽堿(卵磷脂)的兩條脂肪酸尾巴被去掉后所余下的結構部分。
本發明的檢測抗原與抗體結合量的方法基于抗原抗體間反應的特異性和標記物檢測的靈敏性，是一種免疫標記測定方法。即采用酶、熒光劑、放射性同位素、發光劑或電子致密物質標記抗體或抗原，進行抗原抗體間的特異性反應，從而能定量檢測抗體或抗原的量。其中將抗原特異性抗體標記后進行檢測的方法是直接法，采用標記的第二抗體對檢測結果進行放大的方法為間接法。
在本發明的方法中，采用直接化學發光免疫分析法、間接化學發光免疫分析法、直接放射免疫測定法、間接放射免疫測定法、直接酶聯免疫吸附試驗法、間接酶聯免疫吸附試驗法、直接生物素一親和素系統測定法、間接生物素一親和素系統測定法中的任一種來完成。而上述這些直接法和間接法又分別可進一步地分為夾心法和非夾心法。
雙抗體夾心法可如下完成先將抗磷酸膽堿抗體固定在固相載體上，加入含有氧化低密度脂蛋白的樣品，使二者接觸，再加入抗ApoB抗體(或稱抗LDL抗體，Sigma)，使之與氧化低密度脂蛋白接觸，測定抗ApoB抗體的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。或者， 先將抗ApoB抗體固定在固相載體上，加入含有氧化低密度脂蛋白的樣品，使二者接觸，再加入抗磷酸膽堿抗體，使之與氧化低密度脂蛋白接觸，測定抗磷酸膽堿抗體的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。
本發明中的鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白I (CFHR1)基因型的試劑盒可用于檢測年齡相關性黃斑變性(AMD)患者CFHRl基因型。
本發明中的測定血漿樣品中CFHRl含量的試劑盒可用于檢測血漿樣品中CFHRl含量。
本發明中的從血漿中分離純化含CFHRl的高密度脂蛋白的試劑盒可用于分離純化血漿中含CFHRl的高密度脂蛋白。
本發明中的定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結合量的試劑盒可用于檢測血漿樣品中高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl的結合量。
本發明中的檢測血漿樣品中高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的試劑盒可用于檢測血漿樣品中高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原。
本發明中的檢測血漿樣品中CFHRl蛋白與氧化特異性抗原結合的試劑盒可用于檢測血漿樣品中CFHRl蛋白與氧化特異性抗原的結合。
本發明所述的任一試劑盒均可用于檢測年齡相關性黃斑變性(AMD)疾病的發生、 發展。
通過我們建立的計算公式，我們可以推斷出AMD發病的幾率。
本發明的有益效果在于創造性地確認了不同基因型CFHRl通過氧化應激影響 AMD風險的新機制和CFHRl在這一調節過程中的作用。開發出不同基因型CFHRl的檢測試劑盒和檢測方法。這些發現可能會導致在預防和治療老年黃斑退化的新策略，如通過CFHRl 活性的抑制或對其下游的參與脈絡膜形成炎癥基因，包括IL-I的活性抑制，以期能預防和治療老年黃斑退化。本發明的試劑盒具有廣闊的開發應用前景。


圖I、為天然與氧化磷脂的結構圖
IA為天然的磷酸膽堿的分子結構；1B為氧化的磷酸膽堿的分子結構，其中箭頭所指的虛線橢圓框內所示為T15抗氧化磷脂抗體的抗原決定簇。
圖2、CFHRl缺失rs6677604基因型的鑒定圖譜
2A為純和保護性基因型(AA) ;2B為雜和基因型(AG) ;2C為純和致病性基因型 (GG)0
圖3、為高密度脂蛋白樣顆粒的組成部分
3A 為 Westernblot 檢測人血衆；
3B為Westernblot檢測相應的所分離純化的高密度脂蛋白樣顆粒；
rs6677604與純合子AA基因型的樣本被標示成“保護型”;rs6677604純合子GG基因型的樣本被標示成“風險型”。
3C、顯不聞密度脂蛋白樣顆粒含有氧化憐脂(oxPL);縱坐標表不聞密度脂蛋白樣顆粒上氧化磷脂的值，數據以相對光單位(RLU)表示，平均值土SEM。
圖4、重組補體因子H相關蛋白I (rCFHRl)能夠特異性地與氧化磷脂結合
4A顯示rCFHRl能夠與POVPC - BSA，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)呈劑量依賴性結合，但卻不能夠與天然LDL和BSA結合。Nat-LDL表示非氧化的,天然的低密度脂蛋白。
4B顯示oxLDL能夠競爭性抑制rCFHRl與P0VPC-BSA的結合。將rCFHRl與不斷增加濃度的競爭劑預先預孵育，然后添加到一個包被P0VPC-BSA的微孔板，再以抗CFHRl抗體檢測結合到板上的CFHR1。數據表示為BziBtl，其中Btl是沒有競爭劑時CFHRl與抗原的結合值。圖A和B均為三次實驗結果的平均值。
4C 和 4D :血漿中 oxPL (C)或 CRP (C-反應蛋白)(D)的水平與 CFHRlrs6677604 基因型相關(CFHR1 Λ，N=8與CFHR1，N=82)。數據表示為平均相對光單位(RLU) 土SEM。
4E和4F:高密度脂蛋白樣顆粒刺激炎癥性基因表達。圖E，將保護型 (rs6677604AA, CFHRl Δ ,N=4),或風險型(rs6677604GG，CFHRl，N=4)基因型的高密度脂蛋白樣顆粒處理的ARPE-19細胞，然后用定量PCR測定所示基因的表達。圖F表示用氧化低密度脂蛋白處理ARPE-19細胞在有無rCFHRl存在(N=4)的條件下IL-IA的表達。相對mRNA 水平用GAPDH的水平進行調整后，相對于未經處理的樣品進行比對。Nat-LDL表示非氧化的，天然的低密度脂蛋白。
圖5、含CFHRl高密度脂蛋白樣顆粒促進CNV的形成
5A和5C :視網膜下注射含CFHRl高密度脂蛋白樣顆粒誘導CNV的。用isolectin 染色(綠，5A)可以查看到新生血管性活動(箭頭)；而巨噬細胞在視網膜下腔的浸潤(箭頭) 則通過F4/80陽性染色(紅色，5B)觀察所確定。合并后的圖像顯示isolectin和F4/80染色標記新生血管和巨噬細胞浸潤共存在于注射部位附近(5C)。細胞核用DAPI (藍色)反染色顯示。
5D和5E為陰性對照面板，顯示天然低密度脂蛋白注射后沒有促進CNV新生血管的活動(5D)或巨噬細胞的浸潤(5E)。尺寸把100微米。
圖6、oxPL，載脂蛋白Al和CFHRl在AMD共同存在于患者玻璃膜疣
免疫組化顯示，當AMD患者的眼睛切片被如下抗體免疫染色的結果無抗體(6A)， 抗oxPL抗體(6B)，抗載脂蛋白Al (60抗體，和抗0 服1抗體(60)。尺寸把50微米。
圖7、激光誘導脈絡膜CNV實驗結果
7A表示脈絡膜新生血管(CNV)在野生型和IL-I受體敲除小鼠的面積大小比較；7B 表示脈絡膜新生血管(CNV)在野生型小鼠中加入IL-I抑制劑與沒有抑制劑的面積大小比較；
7A和7B中的縱坐標表示新生血管面積(μ m2)
7C和7D為7A中野生型和IL-I受體敲除小鼠的面積的代表性影像；7E和7F為7B 中入IL-I抑制劑與沒有抑制劑的面積的代表性影像。
具體實施方式
本發明中，最初在1560個無血緣關系的歐洲人后裔白種人個體中的CFHrsl061170C/T和CFHRl rs6677604A/G的基因分型，包括886個AMD病人和674個正常對照組。我們的研究結果表明rsl061170和rs6677604的單核苷酸多態性與AMD高度相關 (ρ=4· 53Χ1(Γ16和 4· 98Χ 10,，表 I)。單核苷酸多態性rsl061170 將對missense CFH Y402H 變異編碼，并在之前顯示出與AMD強烈關聯3’5_7。CFHRl表達是否缺失可以通過rs6677604 基因座上的SNP來檢測。若要確定是否與帶有AMD的rs6677604關聯是獨立于rsl061170， 我們執行逐步回歸分析。即在對rs 1061170調后節，rs6677604仍然強烈關聯AMD風險 (p=l. 16X IO-3)。為了進一步驗證這一發現，使用來自密歇根、梅奧、AREDS、賓夕法尼亞州 (MMAP)群體研究的獨立群體(國家眼科研究所，Accession phs000182. v2. pi)來進行同樣的分析。在MMAP的數據集中，SNP rsl0801555作為rsl061170代理SNP(r2=0. 99)9。如所料，遺傳協會MMAP數據的分析顯示，rsl0801555與AMD強烈關聯。調節rsl0801555之后發現，在MMAP群集中rs6677604仍然與AMD大大相關聯(p=2. 38X 1(Γ6，表2)。同時，這些結果確定與AMD風險與CFHRl相關聯并獨立于CFH Υ402Η。究由四川大學華西醫院和圣地亞哥加利福尼亞大學的機構審查委員會批準。所有參與者都提供了書面的知情同意文檔， 都進行了標準的眼部檢查，包括視力測量，擴張狹縫燈顯微鏡、彩色攝影和熒光素眼底血管造影。濕性AMD的診斷是基于根據AREDS所設立的分類得到CNV的存在25。
表ICFH rsl061170)和CFHRl (rs6677604)的單核苷酸多態性與AMD高度相關
權利要求
1.用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物對，包括標記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座CFHRl擴增引物對，其序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示 上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3’ (SEQ ID No I)； 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)。
2.用于對標記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座進行基因型鑒定的引物，其序列如SEQ ID No 3 所示5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
3.權利要求I中所述的引物對在制備鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒中的應用。
4.權利要求2中所述的引物在制備鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒中的應用。
5.用于鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、從人組織樣本中提取DNA模板的試劑； b、用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物，包括標記為rs6677604的CFHRl擴增引物對，其序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示 上游引物:5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQ ID No I) 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)； c、用于對DNA擴增產物的片斷進行基因型鑒定的引物序列，包括rs6677604標記的CFHRl基因型鑒定的引物序列，其序列如SEQ ID No 3所示5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的人組織樣本為外周血樣本。
7.鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a、從人組織樣本中提取和純化DNA模板； b、利用DNA模板擴增CFHRl基因片段，采用的擴增引物為標記為rs6677604的CFHRl擴增引物對 上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3’ (SEQ ID No I)； 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)； c、使用基因型鑒定的引物序列對步驟b得到的CFHRl的基因片段進行擴增，得到的產物測序進行基因型SNP鑒定，如果其中保護性等位基因為純合子標記為AA ;其中如果致病性等位基因為純合子標記為GG ;其中如果保護性/致病性等位基因為雜合子標記為AG ； 所述的基因型鑒定的引物序列包括rs6677604標記的CFHRl基因型鑒定的引物序列5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
8.測定血漿中CFHRl含量的免疫印跡試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、抗CFHRl的抗體； b、Ci7HRl標準品。
9.測定血漿中CFHRl含量的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a、血漿樣本進行SDS電泳； b、將電泳分離后的膠轉印至尼龍薄膜；C、使抗CFHRl抗體與薄膜上的蛋白結合； d、測定所述抗體與CFHRl的結合量。
10.一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結合量的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、抗載脂蛋白Al抗體； b、抗CFHRl的抗體。
11.一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結合量的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a、用抗載脂蛋白Al抗體將血漿中高密度脂蛋白俘獲； b、抗CFHRl的抗體與高密度脂蛋白樣顆粒樣品接觸； C、使抗CFHRl的抗體與其中的CFHRl結合； d、測定抗CFHRl的抗體與CFHRl的結合量。
12.一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、抗載脂蛋白Al抗體，用于將血漿中高密度脂蛋白樣顆粒俘獲； b、抗磷酸膽堿的抗體，用于與含高密度脂蛋白樣顆粒的樣品接觸。
13.根據權利要求10所述的試劑盒，其特征在于所述抗磷酸膽堿的抗體的基因含有S107VH重鏈可變區和V-kappa 22VL輕鏈可變區。
14.一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 a、用抗載脂蛋白Al抗體將血漿中高密度脂蛋白俘獲； b、抗磷酸膽堿的抗體與含高密度脂蛋白的樣品接觸； C、使抗磷酸膽堿的抗體與氧化磷酸膽堿結合； d、測定抗磷酸膽堿的抗體與氧化磷酸膽堿的結合量。
15.根據權利要求14所述的定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的方法，其特征在于所述的含有氧化高密度脂蛋白樣品為血清、血漿、組織勻漿液或組織提取液。
16.一種定量測定CFHRl與氧化特異性抗原結合的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有下列成分 a、含POVPC的氧化特異性抗原； b、抗CFHRl的抗體。
17.一種定量測定CFHRl與氧化特異性抗原結合的方法，其特征在于包含如下步驟 a、制備含POVPC的氧化特異性抗原； b、包被氧化特異性抗原在微孔板上； C、將血漿中CFHRl與氧化特異性抗原結合； d、用抗CFHRl的抗體測定CFHRl與氧化特異性抗原的結合量。
18.根據權利要求8、10或16所述的試劑盒，其特征在于用于制備抗CFHRl的抗體的多肽的序列如SEQ ID No 4所示。
19.根據權利要求8、10或16所述的試劑盒，其特征在于所述抗CFHRl的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區片段中的任一種。
20.根據權利要求9、11、14或17所述的方法，其特征在于所述步驟d可采用化學發光免疫分析法、酶聯免疫吸附試驗法、生物素一親和素系統測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來測定所述抗體與抗原的結合量。
21.根據權利要求9、11、14或17所述的方法，其特征在于還包括步驟e，即根據以純化的CFHRl或者磷酸膽堿化合物為標準品測得的標準曲線，確定CFHRl的定量或高密度脂蛋白樣顆粒表面的氧化特異抗原決定簇的量。
全文摘要
本發明要解決的技術問題是提供年齡相關性黃斑變性(AMD)疾病發生、發展的診斷試劑。本發明涉及對CFHR1基因型鑒定、血漿樣品中CFHR1含量測定、高密度脂蛋白樣顆粒上CFHR1結合量和CFHR1與氧化特異性抗原結合的試劑盒及其檢測方法。本發明對年齡相關性黃斑變性(AMD)疾病發生、發展的診斷提供了可靠的參照指標。創造性地確認了不同基因型CFHR1。而本發明的工作可能會導致在預防和治療老年黃斑退化的新策略，如通過CFHR1活性的抑制或對其下游的參與脈絡膜形成炎癥基因，包括IL-1的活性抑制，以期能預防和治療老年黃斑退化。具有廣闊的開發應用前景。
文檔編號C12N15/11GK102978204SQ20121045134
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月12日 優先權日2011年11月11日
發明者張康, 彼得.肖 申請人:張康