專利名稱：分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法
技術領域：
本發明屬于酶發酵領域，具體的說，是涉及一種發酵過程中分批補加氮源發酵生產纖維素酶的方法。
背景技術：
纖維素酶具備的水解木質纖維素成糖的能力使得其具有廣泛的應用前景，通過對秸桿等木質纖維素水解，將其發酵成糖，在通過發酵等方法制備燃料乙醇或者其他的化工產品，這也是利用木質纖維素制備能源化工產品當中一個關鍵要素之一，纖維素酶的制備成本和效率也是能否實現生物質基能源化工產品逐漸取代石油能源和化工產品的決定因·
素之一。高活性的纖維素酶發酵技術能夠極大的提高發酵效率節約產酶的成本，傳統的纖維素酶發酵通常采用液體深層間歇式發酵技術即在發酵初始配置發酵培養基時，一次性的投加足量的碳源、氮源、生長因子及微量元素等，通過控制發酵過程中的溫度、融氧、PH等保證微生物能有一個最優的發酵條件從而獲得高發酵活性的纖維素酶。該方法操作簡單，適合大多數微生物的培養，易于推廣。同時該方法在前期一次性投加整個發酵過程中所需的營養，容易導致初始培養基濃度過高造成傳質、傳熱的困難增加了發酵的能耗；發酵前期高濃度的營養會導致整個發酵培養基的滲透壓的增高不利于延滯期菌株的生長；高濃度的營養物質同時會導致前期營養物質大量的用于合成菌株生長所需要的營養，導致菌株大量繁殖，以至于后期發酵合成纖維素酶時營養緊缺從而抑制產酶。
發明內容
本發明的目的在于提供一種分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，通過前期添加少量的氮源在降低發酵液滲透壓的同時降低初始培養基的營養，抑制菌絲的過量繁殖，避免大量的營養用于菌絲生長，發酵后期通過分批補氮源，在限制營養用于菌絲生長的同時保證纖維素酶合成所需要的營養供給，提高營養的利用率，獲得更高的發酵纖維素酶活。本發明的技術解決方案是該纖維素酶的生產方法包括如下步驟
(1)培養基的配制
以纖維質原料為唯一碳源及產酶誘導劑，玉米漿(CSL)、蛋白胨、酵母膏中的一種或幾種作為培養基的有機氮源，銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨水一種或幾種的組合作為培養基的無機鹽氮源，配制培養基，于121°C滅菌20min，培養基在發酵罐中的裝液量以發酵罐裝液容量的60% 80%為宜；
(2)接種與發酵以培養基體積的1°/Γ5%(ν/ν)的接種量接種真菌種子液于發酵罐中發酵，發酵過程參數控制為溫度為28 30°C，溶解氧不低于109Γ20%，通氣量為O. Γθ. 3vvm
(3)過程補料根據發酵過程中真菌的生長與產酶的特性分別在發酵培養第2 3天及4^5天補加質量為初始培養基中無機氮源質量的O. 25、. 5倍的無機氮源或質量為初始培養基中有機氮源質量的O. 25、. 5倍的有機氮源，也可以是同時補加質量為初始培養基中氮源對應質量的O. 25、. 5倍的無機氮源及有機氮源。其中，步驟(I)配制的初始培養基的氮源濃度O. 059Tl% (w/v)0其中，步驟(2)中的真菌為木霉屬、曲霉屬的一種或兩種的組合。其中，所述的纖維質原料為纖維素、微晶纖維素、羧甲基纖維素制備纖維素的一種或幾種的混合。 其中，所述的纖維質原料為經過預處理的木質纖維素，包括農作物秸桿、草類、林木生物質中的一項或幾項的組合。本發明具有以下做點
I、步驟(I)的初始培養基的氮源濃度為較低的水平，以O. 059Tl% (w/v)為宜，以保證前期供應少量氮源用于菌絲生長，防止大量營養用于菌絲繁殖。2、根據真菌的生長與產酶的特性補加氮源，在發酵前期補加無機氮能夠維持菌絲生長的基本營養易于菌絲吸收，發酵后期補加有機氮源能夠在維持菌絲基本營養的基礎上同時提供纖維素酶合成過程中所需的氨基酸等氮源營養，促進纖維素酶大量合成。3、補加氮源可以是單純的補加無機氮或有機氮，也可以是兩種氮源的組合補加。4、通過改變N源的添加方式，在發酵前期添加少量的N源以供菌絲生長，在產酶過程中分批次補加所需的N源以保證蛋白的合成，與傳統的間歇式發酵相比同濃度的C源及其他營養物質的情況下發酵所得的酶活提高了 Γ2倍，極大的提高了產酶發酵營養的利用率，降低了生產成本，使得該培養方法更容易適應產業化的推廣。
圖I為里氏木霉Rut-30傳統間歇式發酵生長與產酶隨發酵時間變化的曲線圖。圖2為里氏木霉Rut-30在發酵第3天及第5天補加有機氮源玉米漿后的發酵生長與產酶隨發酵時間變化的曲線圖。圖3為里氏木霉Rut-30在發酵第3天及第5天補加無機氮源硫酸銨后的發酵生長與產酶隨發酵時間變化的曲線圖。圖4為里氏木霉Rut-30在發酵第3天補加硫酸銨，第5天補加玉米漿的發酵生長與產酶隨發酵時間變化的曲線圖。圖5為黑曲霉傳統間歇式發酵生長與產酶隨發酵時間變化的曲線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術解決方案，這些實施例不能理解為是對技術方案的限制。實施例中的預處理草是稻草，濕度為20%左右，平均長度為2厘米左右；預處理條件是直接將2公斤稻草置于50升的預處理壓力容器中，在200攝氏度的濕熱蒸汽下預處理20 min，預處理后的秸桿烘干后進行粉碎，再通過200目的篩子獲得的。實施例I :以里氏木霉Rutc-30為發酵菌株
在50L發酵罐中，以經過預處理的稻草為產酶的唯一碳源與產酶誘導劑配制培養基，其培養基組分為預處理草 30g/L，玉米漿(CSL)3g/L，(NH4)2SO4 1.4 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L,CoCl2 · 6H20 2mg/L, CaCl2 0. 01 g/L ;121°C滅菌 20min,降溫至 30。。，以 5% 的接種量接種培養好的Rutc-30的種子2L于滅菌后的發酵罐，30°C發酵培養7天產酶發酵結束，測定酶活最高為2. 12u/ml，生長與產酶曲線如圖I所示。實施例2 以里氏木霉Rutc-30為發酵菌株
在50L發酵罐中，以經過預處理的稻草為產酶的唯一碳源與產酶誘導劑配制培養基，其培養基組分為預處理草 30g/L，玉米漿(CSL) lg/L，(NH4)2SO4 1.4 g/L，KH2PO4 2 g/L,MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L,CoCl2 · 6H20 2mg /L, CaCl2 0. 01 g/L ;121°C滅菌 20min,降溫至 30。。，以 2. 5% 的接種量接種培養好的Rutc-30的種子IL于滅菌后的發酵罐，在發酵第3天及第5天分別補加100g/L的玉米漿溶液100ml，30°C發酵培養7天產酶發酵結束；測定酶活最高為3. 21u/ml，生長與產酶曲線如圖2所示。實施例3 以里氏木霉Rutc-30為發酵菌株
在50L發酵罐中，以經過預處理的稻草為產酶的唯一碳源與產酶誘導劑配制培養基，其培養基組分為預處理草 30g/L，玉米漿(CSL)3g/L，(NH4)2SO4 0.5 g/L, KH2PO4 2 g/L,MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L,CoCl2 ·6Η20 2mg/L, CaCl2 0. Olg/ L ;121°C滅菌 20min,降溫至 28。。，以 1% 的接種量接種培養好的Rutc-30的種子400ml于滅菌后的發酵罐；在發酵第2天及第4天分別補加IOOg/L的(NH4)2SO4 100ml，28°C發酵培養7天產酶發酵結束；測定酶活最高為2.85u/ml，生長與產酶曲線如圖3所示。實施例4 以里氏木霉Rutc-30為發酵菌株
在50L發酵罐中，以經過預處理的稻草為產酶的唯一碳源與產酶誘導劑配制培養基，其培養基組分為預處理草 30g/L，玉米漿(CSL)2g/L，(NH4)2SO4 0.5 g/L, KH2PO4 2 g/L,MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L,CoCl2 ·6Η20 2mg/L, CaCl2 0. Olg/ L ;121°C滅菌 20min,降溫至 29。。，以 2. 5% 的接種量接種培養好的Rutc-30的種子IL于滅菌后的發酵罐，在發酵第3天補加100g/L的(NH4)2SO4溶液100ml，第5天補加滅100g/L的玉米漿溶液200ml，29°C發酵培養7天產酶發酵結束；測定酶活最高為3. 56u/ml，生長與產酶曲線如圖4所示。實施例5 以黑曲霉為發酵菌株
以微晶纖維素為產酶的唯一碳源與產酶誘導劑配制培養基，其培養基組分為微晶纖維素 30g/L，蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 ·7Η20 O. 3g/L，FeSO4 ·7Η205mg/L, ZnSO4 · 7Η20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7Η20 I. 6mg/L ;培養基于 50L 的發酵罐 121 °C 滅菌20min,降溫至28°C，以5%的接種量接種培養好的黑曲霉的種子液2L，28°C發酵培養7天產酶發酵結束；測定酶活最高為I. 65u/ml，生長與產酶曲線如圖5所示。實施例6 :以黑曲霉為發酵囷株
以經過微晶纖維素為產酶的唯一碳源與產酶誘導劑配制培養基，其培養基組分為微晶纖維素 30g/L，蛋白胨 5g/L，(MM)2SO4 3 g/L，KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L,FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L ;培養基于 50L 的發酵罐121°C滅菌20min，降溫至28°C，以5%的接種量接種培養好的黑曲霉的種子液2L，在發酵第3天補加100g/L的(NH4)2SO4溶液300ml，第5天補加100g/L的蛋白胨，溶液500ml，28°C發酵培養7天產酶發酵結束；測定酶活最高為2. 53u/mL·圖I、圖2、圖3及圖4顯示與圖I所示的傳統的間歇式發酵里氏木霉Rutc-30相t匕，前期少量的N源發酵菌絲的生物量明顯下降，生物量最高依次分別為20. 04g/L、15. 01g/L、15. 11 g/L及15. 36 g/L，菌絲生長在前期受到了抑制，防止了菌絲大量的生長；補加有機氮或補加無機氮都能提高發酵酶活，單純補加有機氮效果要好于補加 無機氮；在補加的效果中前期補加無機氮后期補加有機氮能獲得最好的補加效果，酶活最高可達3. 56 u/ml,是傳統的I. 7倍左右。圖5為以黑曲霉為發酵菌株的發酵，同樣驗證了補加氮源能有效的提高發酵酶活。本發明公開了一種分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，在發酵前期添加少量的氮源，降低了初始培養基的粘度，提高了傳質傳熱的效率，同時低濃度的氮源降低了發酵培養基溶液的滲透壓，更利于延滯期菌絲的生長；低濃度的氮源在發酵過程中抑制了菌絲的大量生長，降低了非產酶營養消耗的比率，在產酶過程中通過分批補加N源，保證了產酶N源的需求，極大地促進了產酶營養的利用率，同樣營養濃度情況下發酵酶活與傳統發酵提高f 2倍，提高了產酶發酵營養的利用率，降低了生產成本，該培養方法更容易適應產業化的推廣。
權利要求
1.分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，其特征是該纖維素酶的生產方法包括如下步驟 (O培養基的配制以纖維質原料為唯一碳源及產酶誘導劑，玉米漿(CSL)、蛋白胨、酵母膏中的一種或幾種作為培養基的有機氮源，銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨水一種或幾種的組合作為培養基的無機鹽氮源，配制培養基，于121°C滅菌20min，培養基在發酵罐中的裝液量以發酵罐裝液容量的60°/Γ80%為宜； (2)接種與發酵以培養基體積的1°/Γ5%(ν/ν)的接種量接種真菌種子液于發酵罐中發酵，發酵過程參數控制為溫度為28 30°C，溶解氧不低于109Γ20%，通氣量為O. Γθ. 3vvm (3)過程補料根據發酵過程中真菌的生長與產酶的特性分別在發酵培養第2 3天及4^5天補加質量為初始培養基中無機氮源質量的O. 25、. 5倍的無機氮源或質量為初始培養基中有機氮源質量的O. 25、. 5倍的有機氮源，或同時補加質量為初始培養基中氮源對應質量的O. 25、. 5倍的無機氮源及有機氮源。
2.根據權利要求I所述的分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，其特征是其中，所述步驟(I)的初始培養基中的氮源濃度為O. 059Tl% (w/v)0
3.根據權利要求I所述的分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，其特征是其中，所述的真國為木霉屬、曲霉屬一種或兩種的組合。
4.根據權利要求I所述的分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，其特征是其中，所述的纖維質原料為纖維素、微晶纖維素、羧甲基纖維素制備纖維素的一種或幾種的混口 O
5.根據權利要求4所述的分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，其特征是其中，所述的纖維質原料為經過預處理的木質纖維素，包括農作物秸桿、草類、林木生物質中的一項或幾項的組合。
全文摘要
本發明公開了一種分批補加氮源培養真菌生產纖維素酶的方法，包括如下步驟培養基在發酵罐中以60%~80%的裝液量于121℃滅菌20min，降溫至培養溫度28~30℃；以裝液量1%~5%的接種量接種真菌種子液于發酵罐中發酵；分別在發酵培養第2~3天及4~5天補加質量為初始培養基中氮源對應質量的0.25~0.5倍的無機氮源及有機氮源。本發明通過前期添加少量的N源在降低發酵液滲透壓的同時降低初始培養基的營養，抑制菌絲的過量繁殖，避免大量的營養用于菌絲生長，發酵后期通過分批補氮源，在限制營養用于菌絲生長的同時保證纖維素酶合成所需要的營養供給，提高營養的利用率，獲得更高的發酵纖維素酶活。
文檔編號C12R1/885GK102952791SQ20121044982
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月12日 優先權日2012年11月12日
發明者熊鵬, 宇文偉剛, 賀建龍 申請人:熊鵬