專利名稱：穩定表達熒光素酶的a549裸鼠模型及其建立與應用的制作方法
穩定表達熒光素酶的A549裸鼠模型及其建立與應用技術領域
本發明屬于裸鼠模型及其建立與應用領域，特別涉及一種穩定表達熒光素酶的 A549裸鼠模型及其建立與應用。
背景技術：
肺癌是威脅我國人民健康的頭號殺手。據衛生部發布的《2010年中國衛生統計年鑒》，我國2009年惡性腫瘤在所有疾病死亡原因中居首位，統計資料顯示死亡率排名前十位的惡性腫瘤中，肺癌居首位，為我國的社會發展帶來嚴重的經濟負擔。近年來，肺癌的治療和基礎研究取得了較大發展，但目前肺癌藥物的基礎和臨床前研究尚欠缺一種能更方便的評估藥物療效的可靠的體內、體外研究平臺，這嚴重制約了肺癌的基礎和臨床前研究。肺癌動物模型是肺癌研究的重要手段，移植性肺癌模型是目前臨床前藥物實驗最常用的模型。 移植型肺癌模型是將人肺癌細胞移植到動物體內傳代生長，移植的腫瘤細胞形態學特征、 染色體數量、同工酶水平等將保持不變，對臨床抗癌藥物敏感性也大致相同，移植型肺癌模型建立的常用方法是皮將肺癌細胞或組織塊接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下(腋部、背部、后肢等)建立肺癌模型。此模型建模簡單易行，成瘤率高，易監視腫瘤生長情況， 所以常用來作抗癌藥物篩選的動物模型，同時該模型還具有動物來源方便、移植腫瘤細胞生長迅速、倍增時間短、耗費低等優點。但目前應用的移植型肺癌模型對藥物療效的評估多需采取解剖的方法進行評估，操作復雜，受人為操作的影響因素大，不便于臨床前研究。如果能夠建立一種整體可視化肺癌模型，能夠直接進行體外成像·監測評估腫瘤的生長轉移情況，可以對活體動物進行觀察，將大大便利肺癌的臨床前研究，同時也能減少人為因素的干擾，提高評估的準確性。
熒光素酶報告基因(Luc)的應用便利了肺癌整體可視化動物模型的構建。熒光素酶報告基因根據來源不同主要分為細菌熒光素酶(Bacterial luciferase, BL)、螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase’FL)以及海星、發光魚、發光甲蟲等為來源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。BL是由2個多肽亞基組成的異二聚體，相對分子質量約為79X 103。在還原性黃素(FMNH)、八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在時，發射出藍綠光(45(T490nm)。FL由單一的多肽鏈組成，相對分子質量為(60 64) XlO3, 在Mg2+、ATP、O2存在時催化D-熒光素(D-Luciferin)氧化脫羧發光(55(T580nm)。螢火蟲的熒光素_熒光素酶系統是最早建立的發光模型之一，該發光系統采用熒光素底物發光的形式，不需要激發光，具有較高的靈敏度，此外，螢火蟲熒光素酶發出的光組織吸收少，有利于深部組織成像，并且光的強度與標記細胞數量呈線性相關。通過基因工程方法構建熒光素酶的真核表達載體并轉染到癌細胞中，使其表達螢火蟲熒光素酶，進而利用表達熒光素酶的癌細胞接種至動物即可構建整體可視化腫瘤模型，可通過體外成像的方法，對動物體進行活體觀察而不損傷動物。
慢病毒感染較其他轉染方式具有較強的優勢，具有感染譜廣、效率高、可感染非分裂細胞、并可使目的基因穩定整合至宿主基因組因而能夠長期表達、免疫反應小等特點，是一種高效的基因轉移工具。發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種穩定表達熒光素酶的A549裸鼠模型及其建立與應用，與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。
本發明的一種穩定表達熒光素酶的A549裸鼠模型，所述腫瘤模型通過采用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌A549細胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩定表達熒光素酶的腫瘤克隆細胞株，然后采用重組的A549細胞接種于小鼠構建而成。
本發明的一種穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,包括
(I)以前期構建的攜帶有螢火蟲熒光素酶基因的質粒為模板擴增出熒光素酶的cDNA，通過基因克隆的方法插入慢病毒真核表達載體PRRL-CMV質粒中，構建重組質粒 Luc-PRRL-CMV 表達質粒
設計螢火蟲熒光素酶基因特異性引物
(該引物為上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG;下游引物CCTGTC GACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC)；
熒光素酶基因的克隆和慢病毒載體的構建使用該特異性引物PCR擴增螢火蟲熒光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆載體中并轉化大腸桿菌感受態細胞，質粒抽提后運用基因重組方法將熒光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表達載體PRRL-CMV空質粒中并轉化大腸桿菌感受態細胞；
質粒抽提后進行雙酶切和測序證實構建的表達載體的正確性；
(2)慢病毒感染方法將熒光素酶外源基因導入肺癌細胞株的步驟
大腸桿菌擴增熒光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質粒，并純化測定濃度；將
熒光素酶慢病毒載體的包裝熒光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒混合后，用轉染試劑共轉染293T細胞，以產生含有螢火蟲熒光素酶慢病毒顆粒的上清，確定慢病毒顆粒的滴度；
病毒感染以人肺腺癌A549為母細胞，用上述病毒上清進行感染；
擴增建系進行細胞亞克隆篩選，檢測單克隆細胞內的熒光表達情況，篩選出穩定表達熒光素酶報告基因的重組細胞株并進行擴大培養；
(3)腫瘤皮下注射方法
將得到的重組人肺腺癌細胞經消化后重懸于氯化鈉溶液中(200 μ 1)，在裸鼠皮下接種(2Χ IO6)該重組人肺腺癌細胞，監測細胞皮下增殖情況，即得到穩定表達熒光素酶的 Α549細胞株。
所述步驟(I)中的基因重組方法為酶切和連接；其中，酶切具體為采用Xba I和 Sal I雙酶切。
所述步驟(2)中的熒光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒的質量比為1:3、 1:6 或 1:9。
所述慢病毒包裝質粒包括第三代慢病毒復制所需要的三個基因gag、pol和rev。
所述步驟(2)中的轉染試劑為MV40轉染試劑。
所述步驟(2)中通過ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度；通過細胞有限稀釋法進行細胞亞克隆篩選；通過熒光測定儀或活細胞成像儀檢測單克隆細胞內的熒光表達情況。
所述步驟(3)中的氯化鈉溶液質量百分比濃度為O. 9%。
所述步驟(3)中通過游標卡尺測量和活體成像儀監測細胞皮下增殖情況。
本發明的裸鼠模型應用于觀察腫瘤的生長情況和抗腫瘤藥物的治療效果。
所選用的動物除了裸鼠，也可以為SCID鼠。
有益.效果
本發明與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。
圖IA為螢火蟲熒光素酶Luciferase慢病毒載體示意圖IB為質粒酶切鑒定圖2為Luciferase慢病毒載體的包裝；其中，A為目的基因質粒與慢病毒包裝質粒按1:3轉染293T細胞，B為目的基因質粒與慢病毒包裝質粒按1:6轉染293T細胞，C為目的基因質粒與慢病毒包裝質粒按1:9轉染293T細胞；
圖3為包裝后的慢病毒上清感染A549細胞72h ；
圖4為穩定表達Luciferase的A549細胞單克隆篩選；其中，A為Luciferase活性定量分析(RLU)，B為活細胞成像；
圖5為穩定表達Luciferase的A549細胞系生物學特性分析(劃痕試驗)；
圖6為穩定表達Luciferase的A549細胞體內成瘤實驗；其中,A為活體動物成像， B為活體動物成像定量分析，C為腫瘤生長曲線；
圖7為穩定表達Luciferase的A549細胞體內成瘤實驗；其中，A為治療后第12 天活體成像，B為活體成像定量分析，C為治療后不同天數腫瘤生長曲線。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例I
步驟I.熒光素酶基因的克隆和慢病毒載體的構建
在設計螢火蟲突光素酶(Firefly-Luciferase)基因特異性引物后，以攜帶 Luciferase基因質粒為模板(碧云天公司)，PCR擴增出Luciferase cDNA。將擴增的 Luciferase基因成功插入PCR-Blunt載體，轉化感受態大腸桿菌細胞后質粒小抽，Xba I 和Sal I雙酶切后割膠純化回收Luciferase基因片段，將該片段與慢病毒真核表達載體 PRRL-CMV空質粒(Backbone)連接，轉化感受態大腸桿菌細胞后質粒小抽，雙酶切鑒定和測序結果均證明Luciferase-PRRL-CMV表達載體構建成功，經測序證實序列完全正確(約GAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA)(見圖 I)，然后大規模抽提質粒，測定濃度后置_80°C備用。
步驟2.熒光素酶慢病毒載體的包裝與病毒滴度測定
大腸桿菌擴增熒光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質粒，并純化測定濃度。
熒光素酶慢病毒載體用MV40轉染試劑轉染HEK293T細胞制備獲得。
將Luciferase-PRRL-CMV質粒與慢病毒包裝質粒分別按1: 3、1: 6、1:9轉染293T 細胞，結果顯示Luciferase-PRRL-CMV質粒與慢病毒包裝質粒按1:6轉染293T細胞效果最佳(見圖2)。在轉染48和72小時后收集293T細胞培養上清，離心去除細胞碎片后置_80°C 備用。用GFP-PRRL-CMV質粒載體作為陽性對照。HIV p24 ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度。
步驟3.熒光素酶慢病毒上清感染肺腺癌細胞系
將人A549肺腺癌細胞在含10wt%小牛血清和lwt%雙抗的高糖DMEM中傳代培養。 取指數生長期腫瘤細胞，O. 25被％胰蛋白酶(含EDTAM^t精確計數后按2 X IO5個細胞/孔種植于六孔板，待細胞融合度達7(Γ80%時，稀釋polybrene至培養基，使其終濃度為8 μ g/ ml，然后用熒光素酶慢病毒上清以最佳滴度感染A549肺腺癌細胞，同時用GFP慢病毒上清做陽性對照，分別在感染后48h、72h和96h用倒置熒光顯微鏡檢測細胞內GFP表達情況，正常傳代培養后用熒光測定儀和活細胞成像儀檢測細胞內熒光素酶表達情況。以GFP為陽性對照，慢病毒上清感染A549細胞后48h即可觀察到大部分細胞呈GFP陽性表達，72h增強增多，96h達最佳狀態(見圖3)，用該條件進行Luciferase-PRRL-CMV質粒轉染得到的細胞可用于高表達突光素酶的穩轉細胞株的篩選。
步驟4.穩定表達熒光素酶的肺腺癌細胞系的篩選和建立
用有限稀釋法先在IOcm培養皿種植不同濃度的熒光素酶慢病毒感染后A549肺腺癌細胞，培養至單細胞克隆形成后，鏡下挑取48個單克隆細胞至96孔板繼續克隆培養 (每個單克隆細胞設復孔)，用熒光測定儀和活細胞成像儀分別檢測48個單克隆細胞內熒光素酶的表達，選取熒光素酶表達強、細胞生長情況良好的細胞克隆(如圖4中3號單細胞克隆)，并采用劃痕試驗證實細胞(luc-A549)較轉染前生物學特性(增殖和遷移能力等)沒有發生明顯改變(見圖5)，對穩定表達熒光素酶的A549細胞進行擴大培養，用于腫瘤模型的制作。
步驟5.穩定表達熒光素酶的肺腺癌細胞腫瘤模型的建立
將穩定表達熒光素酶的A549肺腺癌細胞(Luc-A549)培養于含10wt%小牛血清和 lwt%雙抗的高糖DMEM中，37°C、5%volC02培養條件下傳代擴增。取指數生長期腫瘤細胞，O.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化，醫用O. 9被％氯化鈉溶液重懸，離心洗滌，精確計數后調整細胞懸液濃度備用。選取6 8周齡雌性Balb/c裸J小鼠皮下接種LUC-A549細胞(I X IO6個 /200μ1)。于SPF條件下正常飼養并定期觀察體內成瘤情況。在接種后的第5、10、15、20、 25天用游標卡尺測量腫瘤的長軸(a)和短軸(b )，按公式V=O. 5 X ab2，計算腫瘤體積(mm3); 在接種后的第7、14、21天用小動物活體成像儀(德國BERTHOLD，NightOffL II LB983)檢測體內腫瘤的發光強度(photon/sec/cm2/steridian),用O. 4%戍巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，再按15mg/kg體重腹腔注射D-突光素鉀鹽(D-Luciferin Potassium Salt)工作液，10-15分鐘后，將裸鼠仰臥于小動物活體成像儀載物臺上進行圖像采集和分析，可以觀察到構建的表達Luciferase的A549細胞的C57BL/6J小鼠體內腫瘤的發光強度隨生長天數逐漸增強，且腫瘤生長曲線顯示腫瘤發光強度與腫瘤體積曲線正相關(見圖6)。
步驟6.待構建的Luc-A549 C57BL/6J小鼠腫瘤模型腫瘤體積達IOOmm3左右將動物隨機分組用于藥物治療。
分組治療如下(1)生理鹽水對照組；(2) Gemcitabine組(腹腔注射,60mg/kg裸鼠，每三天注射一次)。各組持續治療3周，分別在治療的第3、6、9、12、15天測量腫瘤體積， 并在第12天用活體成像儀檢測腫瘤的發光強度，以此確定腫瘤的生長和藥物治療效果。活體成像定量分析結果顯示，對照組和治療組間腫瘤的發光強度不同，且與治療后不同天數腫瘤生長曲線正相關,說明A549細胞熒光素酶腫瘤模型能夠用來反映抗腫瘤藥物的治療效果(見圖7)。
權利要求
1.一種穩定表達熒光素酶的A549裸鼠模型，其特征在于所述裸鼠模型通過采用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌A549細胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩定表達熒光素酶的腫瘤克隆細胞株，然后采用重組的A549細胞接種于小鼠構建而成。
2.—種穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,包括(1)設計螢火蟲熒光素酶基因特異性引物；使用該特異性引物PCR擴增螢火蟲熒光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆載體中并轉化大腸桿菌感受態細胞，質粒抽提后運用基因重組方法將熒光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表達載體PRRL-CMV空質粒中并轉化大腸桿菌感受態細胞，質粒抽提后進行雙酶切和測序證實構建的表達載體的正確性；(2)大腸桿菌擴增熒光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質粒，并純化測定濃度；將熒光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒混合后，用轉染試劑共轉染293T細胞，以產生含有螢火蟲熒光素酶慢病毒顆粒的上清，確定慢病毒顆粒的滴度；以人肺腺癌A549為母細胞,用上述病毒上清進行感染；進行細胞亞克隆篩選，檢測單克隆細胞內的熒光表達情況，篩選出穩定表達熒光素酶報告基因的重組細胞株并進行擴大培養；(3)將得到的重組人肺腺癌細胞經消化后重懸于氯化鈉溶液中，在裸鼠皮下接種該重組人肺腺癌細胞，監測細胞皮下增殖情況，即得到穩定表達熒光素酶的A549細胞株。
3.根據權利要求2所述的一種穩定表達突光素酶的A549細胞株的建立方法,其特征在于所述步驟(I)中的特異性引物為上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG ；下游引物CCTGTCGACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC ；基因重組方法為酶切和連接；其中，酶切具體為采用Xba I和Sal I雙酶切。
4.根據權利要求2所述的一種穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步驟(2)中的熒光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒的質量比為1:3、1:6 或 1:9。
5.根據權利要求2或4所述的一種穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法， 其特征在于所述慢病毒包裝質粒包括第三代慢病毒復制所需要的三個基因gag、pol和revo
6.根據權利要求2所述的一種穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步驟(2)中的轉染試劑為MV40轉染試劑。
7.根據權利要求2所述的一種穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步驟(2)中通過ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度；通過細胞有限稀釋法進行細胞亞克隆篩選；通過熒光測定儀或活細胞成像儀檢測單克隆細胞內的熒光表達情況。
8.根據權利要求2所述的一種穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步驟(3)中的氯化鈉溶液質量百分比濃度為O. 9%。
9.根據權利要求2所述的一種穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步驟(3)中通過游標卡尺測量和活體成像儀監測細胞皮下增殖情況。
10.一種如權利要求I所述的穩定表達突光素酶的A549裸鼠模型的應用,其特征在于 所述腫瘤模型應用于觀察腫瘤的生長情況和抗腫瘤藥物的治療效果。
全文摘要
本發明涉及一種穩定表達熒光素酶的A549裸鼠模型及其建立與應用，所述裸鼠模型通過采用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌A549細胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩定表達熒光素酶的腫瘤克隆細胞株，然后采用重組的A549細胞接種于小鼠構建而成。本發明與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/867GK102936600SQ20121044433
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年11月8日
發明者房健民, 周爽, 楊洋, 李棟 申請人:同濟大學蘇州研究院