人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的一種檢測方法
【專利摘要】本發明涉及人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的一種檢測方法。主要步驟包括：根據淋巴細胞gdf15基因表達序列設計引物和Taqman-MGB探針，構建含有淋巴細胞gdf15基因表達序列的重組載體作為標準物質；以10倍系列稀釋的標準物質進行實時熒光PCR，繪制絕對定量標準曲線；對接受不同劑量電離輻射后不同培養時間淋巴細胞gdf15基因的表達水平定量測定，獲得輻射劑量和gdf15基因表達水平的擬合劑量效應曲線；對待測輻射劑量的人外周血淋巴細胞gdf15基因的表達水平定量測定，計算待測淋巴細胞所受的電離輻射劑量。本發明能夠快速定量檢測人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量，達到簡便，快速定量，高通量的要求，在遇到大規模輻照事故時，可以凸顯其優勢。
【專利說明】人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的一種檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于輻射生物劑量估算領域，具體涉及人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的檢測方法。
【背景技術】
[0002]電離輻射對機體的損傷是通過原發作用的直接和間接作用，引起生物分子結構和性質的變化，由分子水平的損傷進一步造成了細胞水平、器官水平和整體水平的損傷，出現相應生化代謝紊亂并由此產生一系列表現或造成死亡和產生某些遠后效應。
[0003]在核戰爭和核或放射事故中，大量受照人群的分選和急救是搶救可治愈人群(IOGy以下)的關鍵，而成功的救助需要快速、準確的估算受照劑量。目前估算劑量的方法很多，包括物理的和生物的方法。生物學方法具有其優越性，輻射生物劑量計在核事故受害者受照劑量估算及輻射生物學效應研究中具有重要的應用價值。理想的電離輻射生物劑量計應具備的特點包括:①具有電離輻射可誘導性，特異良好的量-效關系；②確定的劑量和時間響應范圍遺傳背景穩定，本底變異較低；④影響、干擾因素明確且可控制；⑤采樣方便，分析方法簡單、迅速、可靠，易于自動化大通量操作；⑥經濟成本和社會成本低等特點。
[0004]目前常用的生物劑量計有早熟凝聚染色體片段分析、微核分析、穩定染色體畸變分析、體細胞基因位點突變分析等。但這些技術相對復雜，需要良好的專業知識和訓練后才能夠順利開展，而且在大量人群受到照射的情況下不能滿足高通量檢測、生物輻射劑量快速定量檢測的需求。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種快`速定量、高通量估算人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的檢測方法。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0007]人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的一種檢測方法，包括如下步驟:
[0008](I)、根據淋巴細胞gdf 15基因表達序列設計引物和Taqman-MGB探針，構建含有淋巴細胞gdf 15基因表達序列的重組載體作為標準物質；
[0009](2)、以步驟(1)所述引物和Taqman-MGB探針對10倍系列稀釋的標準物質進行實時熒光PCR，繪制絕對定量標準曲線；
[0010](3)、將正常人外周血中分離的淋巴細胞分組接受不同劑量的電離輻射，按照步驟
(2)所述實時熒光PCR的方法對輻射后不同培養時間淋巴細胞gdf 15基因的表達水平定量測定，獲得輻射劑量和gdf 15基因表達水平的擬合劑量效應曲線；
[0011](4)、按照步驟(2)所述實時熒光PCR的方法對待測輻射劑量的人外周血淋巴細胞gdfl5基因的表達水平定量測定，根據步驟(3)所述的擬合劑量效應曲線計算待測淋巴細胞所受的電離輻射劑量。[0012]上述技術方案中，步驟⑴所述的淋巴細胞gdfl5基因表達序列如SEQ ID NO:1 ；所述引物的上游引物如SEQ ID NO:2，下游引物如SEQ IDNO:3 ;Taqman_MGB探針序列如SEQID NO:4，探針的熒光基團為FAM，淬滅基團為NFQ。
[0013]本發明提供的人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的檢測方法，是根據人外周血淋巴細胞gdfl5基因表達序列設計引物及TaqMan-MGB探針，以構建的含有淋巴細胞gdfl5基因表達序列的重組載體10倍系列稀釋作為標準品模板，在熒光定量PCR儀上進行PCR反應，繪制標準曲線，斜率為-3.5345，相關系數R2 = 0.999，呈現很好的線性關系，擴增效率為99.7%。靈敏度檢測結果表明，PCR反應31個循環時可以檢測到的質粒最小濃度是50拷貝數/ μ L，選用50、500、5000、50000和500000拷貝數/ μ L5個濃度梯度質粒做模板，變異系數在1.2% -3.2%范圍內，說明該方法具有良好的重復性和穩定性。本發明通過優化TaqMan-MGB探針熒光定量PCR反應條件和反應體系，能夠快速定量檢測人外周血淋巴細胞gdf 15基因在接受電離輻射時的表達水平變化，與現有的輻射后早熟凝聚染色體片段分析、微核分析、穩定染色體畸變分析、體細胞基因位點突變分析等方法相比，可以大大的節省時間，達到簡便，快速定量，高通量的要求，在遇到大規模輻照事故時，可以凸顯其優勢。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為標準物質重組pUC57質粒的構建示意圖。
[0015]圖2為標準物質重組PUC57質粒瓊脂凝膠電泳圖。
[0016]圖3為10倍系列稀釋的標準物質繪制的標準曲線。橫坐標表示基因拷貝數的對數值，縱坐標表示Ct值。
[0017]圖4為輻射后淋巴 細胞培養4、8、12、24和48小時的擬合劑量效應曲線。
【具體實施方式】
[0018]以下通過實施例詳細描述本發明提供的檢測人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的方法。下面實施例中所涉及的生物技術沒有特別描述之處均采用細胞遺傳學常規技術，如《分子克隆實驗指南》中提供的常規技術方法。
[0019]實施例1:TaqMan_MGB探針及引物對設計
[0020]I)、根據淋巴細胞gdfl5基因表達序列設計上下游引物和探針序列。
[0021]發明人利用基因芯片技術對0.5、3和SGy三個劑量組的45200個基因進行差異表達篩選，其中淋巴細胞gdf 15正調控基因的劑量變化趨勢明顯，對gdf 15基因外周血水平的表達變化進行探索具有重要的實用價值，更接近于應用。
[0022]淋巴細胞gdf 15基因表達序列SEQ ID NO:1為:
[0023]GACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATGAGCAGTCCTGGTCCTTCCACTGTGCACCTGCGCGGAGGACGCGACCTCAGTTGTCCTGCCCTGTGGAATGGGCTCAAGGTTCCT。
[0024]上游引物SEQ ID NO:2 為:5’ -GTTAGCCAAAGACTGCCACTG-3’。
[0025]下游引物SEQ ID NO:3 為:5’ -CCTTGAGCCCATTCCACA-3’。
[0026]探針核苷酸序列SEQ ID NO:4 為:CCGCGCAGGTGCACAG。
[0027]實施例2:標準物質重組pUC57質粒的構建
[0028]I)、常規方法從人外周血中分離單個淋巴細胞；[0029]2)、常規方法提取單個淋巴細胞的RNA，并逆轉錄為cDNA ；
[0030]3)、特異性引物PCR擴增淋巴細胞gdfl5基因；
[0031]4)、PCR產物純化后，按照圖1標準物質重組PUC57質粒的構建示意圖，將PCR產物連接到PUC57質粒(上海生工公司提供)，構建重組pUC57質粒，圖2為標準物質重組pUC57質粒瓊脂凝膠電泳圖。
[0032]5)、重組pUC57質粒測序驗證，結果為淋巴細胞gdf 15基因表達序列SEQ ID NO:1正確插入pUC57質粒中。
[0033]實施例3:標準曲線的制備
[0034]1)、標準物質重組pUC57質粒10倍系列稀釋。利用NanoDrop 2000紫外分光光度儀測定標準物質重組PUC57質粒的濃度，分別將標準物質用雙蒸水稀釋到108拷貝/μ I。在5個0.5ml的離心管中分別加入9μ I雙蒸水，吸取1 μ 1108拷貝/ μ I的標準物質，加入9μ1雙蒸水中充分混勻，再依次進行梯度稀釋，將標準物質分別稀釋成107、106、IO5UO4和103拷貝/ μ 1，以備96孔板上樣時使用。
[0035]2)、以10倍稀釋的標準物質重組PUC57質粒為模板進行熒光定量PCR。
[0036]實時熒光定量PCR儀器為美國ABI公司的7500fast Real Time PCR測量儀，優化后的反應體系為20 μ 1，其中IOylMaster Mix (美國ABI公司提供，內含buffer，dNTP，Taq DNA聚合酶)，2 μ I標準物質模板，7 μ I雙蒸水和1μ I Taqman探針及引物對(引物最終工作濃度為900ηπιο1/μ 1，探針最終工作濃度為250ηmο1/μ I)。反應條件:95°C預變性10分鐘(min)后進行下述40個循環:95°C變性15秒(s)，60°C退火和延伸共lmin。每個樣品設置三個平行樣復孔；另外，每塊96孔板上樣時都要設立三個無cDNA模板的空白對照。Taqman-MGB探針(美國ABI公司提供)的熒光基團為FAM，淬滅基團為NFQ。
[0037]通過對各個濃度標準物質測定的Ct值及樣品拷貝數對數值繪制定量的標準曲線，圖3為10倍系列稀釋的標準物質繪制的標準曲線，橫坐標表示基因拷貝數對數值，縱坐標表示Ct值，斜率為-3.5345，相關系數R2 = 0.999，呈現很好的線性關系(y=-3.5345X+42.495)，擴增效率為99.7%。靈敏度檢測結果表明，PCR反應31個循環時可以檢測到的質粒最小濃度是50拷貝數/ μ L，選用50、500、5000、50000和500000拷貝數/μ L 5個濃度梯度質粒做模板，變異系數在1.2% -3.2%范圍內，說明該方法具有良好的重復性和穩定性。
[0038]實施例4:獲得輻射劑量和人外周血淋巴細胞gdfl5基因表達水平的擬合劑量效應曲線
[0039]1)人群外周血淋巴細胞gdfl5基因本底表達水平分析。
[0040]選取73名志愿者，其中男性39名，女性34名，年齡分布為20_60歲。分析步驟如下:采集志愿者血樣4ml，用實驗室常規方法(如《分子克隆實驗指南》)分離外周血淋巴細胞，提取總RNA，進行cDNA鏈的合成。以cDNA為模板按照實施例3提供的實時熒光定量PCR反應體系和反應條件測定人群外周血淋巴細胞gdf 15基因本底表達拷貝數。本底水平測量的結果顯示，不同性別(如表1)和不同年齡組(如表2) gdf 15基因本底表達水平沒有統計學差異(實驗數據采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，雙側檢驗P < 0.05)，測量結果如表1和表2。
[0041]表1.不同性別組間gdfl5基因mRNA本底表達水平
【權利要求】
1.人外周血淋巴細胞所受電離輻射劑量的一種檢測方法，其特征包括如下步驟: (1)、根據淋巴細胞gdf15基因表達序列設計引物和Taqman-MGB探針，構建含有淋巴細胞gdfl5基因表達序列的重組載體作為標準物質； (2)、以步驟(1)所述引物和Taqman-MGB探針對10倍系列稀釋的標準物質進行實時熒光PCR，繪制絕對定量標準曲線； (3)、將正常人外周血中分離的淋巴細胞分組接受不同劑量的電離輻射，按照步驟(2)所述實時熒光PCR的方法對輻射后不同培養時間淋巴細胞gdf 15基因的表達水平定量測定，獲得輻射劑量和gdf 15基因表達水平的擬合劑量效應曲線； (4)、按照步驟(2)所述實時熒光PCR的方法對待測輻射劑量的人外周血淋巴細胞gdfl5基因的表達水平定量測定，根據步驟(3)所述的擬合劑量效應曲線計算待測淋巴細胞所受的電離輻射劑量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的淋巴細胞gdf15基因表達序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述引物的上游引物如SEQIDNO:2，下游引物如SEQ ID NO:30
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述Taqman-MGB探針含有如SEQID NO:4所不的喊基序列。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述Taqman-MGB探針熒光基團為FAM，淬滅 基團為NFQ。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805683SQ201210444265
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月9日 優先權日:2012年11月9日
【發明者】劉青杰, 張慶召, 張德欽, 高玲, 封江彬 申請人:中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所