專利名稱：一種檢測M BCR融合基因mRNA表達量的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種檢測M BCR融合基因mRNA表達量的試劑盒。
背景技術：
慢性粒細胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)患者的血細胞中除了90%出現Phl染色體陽性以外，還多伴隨有t (9 ；22) (q34 ；qll)易位，即位于9號染色體長臂上的abl原癌基因易位到22號染色體長臂的斷裂點集中區bcr，形成M BCR融合基因。該融合基因負責編碼具有增強酪氨酸激酶的活性的P210蛋白，從而改變細胞多種蛋白質 酪氨酸磷酸化水平和細胞微絲機動蛋白的功能，導致細胞內信號傳導異常，使細胞喪失對周圍環境的反應性，延緩凋亡的發生。BCR-ABL融合基因轉陰率和Ph+細胞消失率與慢性粒細胞白血病患者的疾病進展密切相關。一旦BCR-ABL融合基因轉陰率和Ph+細胞消失率得不到及時改善，慢性粒細胞白血病將有可能從慢性期發展到加速期和急變期。酪氨酸激酶抑制劑是治療慢性粒細胞白血病的主要藥物，但有患者對此類藥物存在原發性抵抗或者由于長期給予此藥而出現繼發性抵抗，發生藥物抵抗的主要原因與M BCR融合基因的表達水平有關。M BCR融合基因表達水平高的急變期多表現對此類藥物的敏感性降低，同時誘變出對此類藥物抵抗的突變克隆的時間縮短。實時突光定量PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應)技術實現了 PCR從定性到真正意義的定量的飛躍，為人類疾病基因的定量檢測提供了一個行之有效的檢測工具，與普通PCR相比具有更強的特異性和靈敏度，而且檢測快速、降低了污染等優點，但目前尚未有關實時熒光定量PCR方法檢測M BCR融合基因。
發明內容
為解決上述技術問題，本發明實施例提供了一種檢測M BCR融合基因mRNA表達量的試劑盒。本發明所提供的檢測M BCR融合基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括M BCR融合基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中M BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；M BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；M BCR融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。進一步地，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQIDNO:9所示；內部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。進一步地，所述M BCR融合基因Taqman熒光探針和ABL基因Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA，所述內部陽性控制序列Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。具體地，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有M BCR融合基因的總RNA樣品。 具體地，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/L MgCl24uL, IOX逆轉錄酶緩沖液2u L, IOmmoI/L dNTP 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 u L, Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV 逆轉錄酶 I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 ii L。具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應體系終濃度表示)為1X的PCR預混合液(原液為 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、
0.2U/ ii L的Taq酶和0. 01-0. 05U/ ii L的UNG酶以及無RNase去離子水。本發明試劑盒的優點和效果如下(I)敏感性高可重復敏感度為0.01%，即10000個細胞中有一個含M BCR融合基因就可以被檢測出。(2)特異性強使用特異性探針對定量分子進行識別，準確性高，同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好且假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴增和檢測可以在同一管內檢測，不需要開蓋，不易被污染，同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔心放射性污染。(4)全程監控本發明實施例提供的試劑盒引入了內部陽性控制質量控制體系，對檢測過程進行全程質量監控，有效避免假陽性或者假陰性。(5)快速速度快并且高通量，檢測實驗可在3-4小時完成。本發明的試劑盒能快速、準確的定量檢測M BCR融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發生，用于慢性粒細胞白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監測，為慢性粒細胞白血病的診斷、制定治療方案及療效評價和預后提供了重要的檢測手段。
為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖IA是本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的內部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖；圖IB是由本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增
I.OxlO6-L OxlO3拷貝的內部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖得到的標準曲線圖；圖2A是本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品的熒光曲線圖；圖2B是由本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增
I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品熒光曲線圖得到的標準曲線圖。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。實施例I.本發明試劑盒的制備I、特異性的引物和熒光探針的設計根據基因序列(ABL基因序列、BCR基因序列來源于美國國家生物技術信息中心核酸數據庫，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號為NM 005157. 4 ;BCR基因ID分別為613，參考序列號為NG_009244. I)分別設計對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分本發明試劑盒組成如下①RNA 提取試劑Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產品貨號15596_026/100ml)，每Iml骨髓組織加入ImlTrizol快速提取慢性粒細胞白血病患者骨髓組織RNA。②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，產品貨號K1622):25mmol/LMgCl24 u L, IOX 逆轉錄酶緩沖液 2u L, IOmmoI/L dNTP 2 u L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)0. 5 u L, Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 u L0③引物、探針和標準品包括M BCR融合基因引物、內部陽性控制序列引物、內參基因ABL引物以及與引物對應的Taqman熒光探針，具體如下M BCR融合基因上游引物序列為5’-AAACTCCAGACTGTCCACAGCAT-3’(序列表中序列I);M BCR融合基因下游引物序列為5’-TAGCCTAAGACCCGGAGCITT-3’(序列表中序列
2)；M BCR 融合基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -CGCTGACCATCAAT-3 ’ TAMRA (序列表中序列3)；內部陽性控制序列為5’ -GUGUGAAACUCCAGACUGUCCACAGCAUUC CGCUGAGCAUGAAUAACGAAGACUAAAGGUGAAAAGCUCCGGGUCUUAGGCUAUAAUC-3，(序列表中序列 7 );內部陽性控制序列上游引物序列為5’ -GTGTGAAACTCCAGACTGTCCACA-3’(序列表中序列8)；內部陽性控制序列下游引物序列為5’-GTTATAGCCTAAGACCCGGAG-3’(序列表中序列9)；內部陽性控制序列Taqman熒光探針TET 5’ -TCCGCUGAGCATG-3’ TAMRA (序列表中序列10)。ABL 基因序列為5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL基因上游引物序列為5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6);
其中，內部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的M BCR融合基因序列和一部分人工合成序列；內部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標準品。上述引物序列、控制序列、基因序列、基因序列和探針序列均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有M BCR融合基因的總RNA樣品為陽性對照，采用上述實施例I中提供的本發明試劑盒組成①RNA提取試劑=Trizol試劑(Invitrogen公司，產品貨號15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑的比例，快速提取已經確診的含有M BCR融合基因的慢性粒細胞白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對照。⑤M BCR融合基因熒光定量PCR的反應液由熒光定量PCR混合液和檢測MBCR融合基因的引物、探針組成1X的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212，2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/u L的Taq酶和0. 01-0. 05U/ y L的UNG酶、0. 25pmol/y L的M BCR融合基因上游引物(序列表中序列1)、0. 25pmol/u L的M BCR融合基因下游引物(序列表中序列2)、0. 3pmol/u L的M BCR融合基因Taqman熒光探針(序列表中序列3)、0. 25pmol/uL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/uL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/uL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。通常取1-2 u L的模板(包括被測樣品RNA反轉錄合成的cDNA和內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA)，其余為無RNase去離子水，反應總體積通常為20 u L0⑥ABL內參基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內參基因的引物、探針組成=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/u L 的 Taq 酶和0. 01-0. 05U/ u L的UNG酶、0. 25pmol/u L的ABL內參基因上游引物(序列表中序列4)、0. 25pmol/ ii L的ABL內參基因下游引物(序列表中序列5)、0. 3pmol/ u L的ABL基因Taqman熒光探針(序列表中序列6)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，力口A ABL基因標準品模板2 u L,其余為無RNase去離子水,反應總體積通常為20 u L。⑦內部陽性控制序列熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測內部陽性控制序列的引物、探針組成=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的Taq酶和0. 01-0. 05U/ U L的UNG酶、0. 25pmol/uL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/uL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/uL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 U L的模板(內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA)，其余為無RNase去離子水,反應總體積通常為20 u L。3、PCR擴增程序的設定在Iightcycler儀器上先經過50°C 10s, 95°C lOmin,然后再經過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環。實施例2.用實施例I制備的試劑盒檢測M BCR融合基因mRNA的表達量以檢測30例慢性粒細胞白血病患者骨髓組織標本結果為例。
用實施例I提供的本發明的試劑盒檢測M BCR融合基因mRNA表達量的檢測流程為首先根據基因序列設計特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進行逆轉錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制ABL內參基因和內部陽性控制序列的熒光定量PCR反應液，將內部陽性控制序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內部陽性控制序列標準品的標準曲線(如圖IA和圖IB所ttO和ABL基因標準品標準曲線(如圖2A和圖2B所ttO，然后再配制M BCR融合基因熒光定量PCR反應液，進行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數據分析系統中讀出CT值結果。PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，分別計算M BCR融合基因及ABL基因的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結果采用軟件分析，并標化計算樣本數據。具體步驟如下①慢性粒細胞白血病骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提慢性粒細胞白血病骨髓組織樣品的總RNA。提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算RNA的純度與濃度，用0. 1% DEPC處理的水調節抽提的各樣品RNA至相同濃度。②反轉錄合成cDNA :取L上述RNA提取液，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24uL,10X逆轉錄酶緩沖液 2u L, IOmmoI/L dNTPs 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 u L, Oligo (dT) 150. 5 y g 和 AMV逆轉錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 ii L,于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈。反應結束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉錄酶，加20 y L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I ii L濃度為2 U g/ml內部陽性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保溫IOmin,隨后加入實施例I提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24ii L，10X 逆轉錄酶緩沖液 L，10mmol/L dNTPs 2 y L，RNA 酶抑制劑 0. 5 y L，Oligo (dT) 150. 5 ii g和AMV逆轉錄酶I. 5U，補加無RNase去離子水至總體積20 y L，于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應,合成cDNA。反應結束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉錄酶，加20 ii L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I ii L濃度為2 U g/ml的陽性對照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24uL,10X逆轉錄酶緩沖液 2u L, IOmmoI/L dNTPs 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 u L, Oligo (dT) 150. 5 y g 和 AMV逆轉錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 ii L,于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應，合成cDNA。反應結束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉錄酶，加20 y L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。③將內部陽性控制基因序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實施例I提供的內部陽性控制序列和ABL內參基因的熒光定量PCR反應液，分別制作內部陽性控制序列標準品標準曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標準品標準曲線(如圖2A和圖2B所示)。
④M BCR融合基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 y L :含I X PCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2 XPCR Premix) 10. Ou L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，M BCR 融合基因上游引物終濃度0. 2iimol/L，M BCR融合基因下游引物終濃度0. 2iimol/L，M BCR融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 U mol/L,被測樣品RNA反轉錄合成的cDNAl. 0 y L，同時加入內部陽性控制序列的上、下游引物終濃度均為0. 2iimol/L，內部陽性控制序列Taqman熒光探針終濃度0. 3 u mol/L,終濃度為0. 2 u mol/L的內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA(②中反轉錄合成的cDNA),加入超純水至總體積20 y L。在Iightcycler突光定量PCR儀上反應擴增條件95°C IOmin預變性，然后95 V 15s，60。。lmin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑤ABL內參基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 ii L :含2XPCR混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix) 10. Ou L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物終濃度均為0. 2 ii mol/L, ABL基因的Taqman熒光探針終濃度0. 2 y mol/L, ABL基因cDNAl. OuL,加入無RNase去離子水補至總體積20 y L。在Iightcycler突光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s, 60°C lmin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑥陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 ii L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix)10. 0 u L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，M BCR融合基因上、下游引物終濃度均為0. 2iimol/L，M BCR融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 u mol/L,陽性對照RNA反轉錄合成的cDNA LOuL或者陰性對照去離子水I. 0 y L，加入無RNase去離子水補至總體積20 y L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s，60°C lmin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集突光信號。⑦數據收集處理和分析PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進行檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，得出M BCR融合基因相對于ABL內參基因的相對表達量后再進行統計分析，以比值大于或等于0. 0001為陽性表達，小于0. 0001為陰性表達(具體參見表I)表I為熒光定量PCR分析M BCR融合基因在慢性粒細胞白血病患者骨髓中的表達
權利要求
1.一種檢測M BCR融合基因mRNA表達量的試劑盒，包含檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括M BCR融合基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中 M BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示； M BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示； M BCR融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQIDN0:7所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；內部陽性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述MBCR融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA，所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
4.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ IDN0:11 所示。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有M BCR融合基因的總RNA樣品。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/LMgC 124 u L, IOX 逆轉錄酶緩沖液 2 ii L，IOmmoI/L dNTP 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 y L,Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 ii L。
7.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的PCR 預混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq酶、0. 01-0. 05U/ i! L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發明涉及一種檢測M BCR融合基因mRNA的熒光定量PCR診斷試劑盒，屬于生物技術領域。包含檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括M BCR融合基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針。能有效地檢測e14a3、e13a3、e14a2和e13a2等M BCR融合基因形式。M BCR融合基因是多能造血干細胞惡性克隆的基因標志，是慢性粒細胞白血病典型的分子標志物，其與抑制白血病細胞的凋亡有關。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測M BCR融合基因mRNA表達量，其檢測結果的特異性和敏感度均顯著提高。本發明試劑盒為臨床慢性粒細胞白血病患者制定治療方案以及預測預后提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術。
文檔編號C12Q1/68GK102965433SQ20121044368
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年9月29日
發明者李艷, 童永清 申請人:李艷, 童永清