專利名稱：一種兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物，包括植物內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。植物內(nèi)生細(xì)菌易于定殖在植物體內(nèi)，相對于植物外生生防微生物，在定殖方面更具優(yōu)勢。
棲居于同一生態(tài)位的根結(jié)線蟲與土傳病原菌協(xié)同侵染同一寄主引起的復(fù)合病害往往比單一病原病害造成的損失更大，也較難防治(Back MA, Haydock PPJ, Jenkinson P. 2002. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology, 51，683 - 697)。根結(jié)線蟲相關(guān)復(fù)合病害的首例報(bào)道來自根結(jié)線蟲與尖孢鐮刀菌復(fù)合侵染棉花(Atkinson GFj 1892. Some diseases of cotton. Alabama Polytechnical Institute of Agriculture - Experimental Station Bulletin, 41，61-65)。迄今，根結(jié)線蟲與植物病原真菌和病原細(xì)菌引起的復(fù)合病害在煙草、苜蓿、棉花、香蕉、咖啡，以及豆類、番茄等蔬菜作物已被廣泛報(bào)道(孫翠平，吳慧平， 楊傳廣.2007.合肥地區(qū)南方根結(jié)線蟲入侵對番茄青枯病發(fā)生的影響.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 35 (23) ,7196-7197)。由根結(jié)線蟲和煙草疫霉分別引起煙草根結(jié)線蟲病和煙草黑脛病是烤煙種植中的兩大主要土傳病害。而由根結(jié)線蟲和煙草疫霉協(xié)同侵染引起的復(fù)合病害在云南、貴州、河南等主要煙區(qū)危害嚴(yán)重，損失巨大，防治難度較大(喻盛甫，胡先奇，王揚(yáng). 1999.包含病原線蟲的植物復(fù)合侵染病害.植物病理學(xué)報(bào)，29(1)，1-7)。
根結(jié)線蟲與土傳病原菌復(fù)合病害的防治難度體現(xiàn)在兩個(gè)方面一是采取的措施只有對病原線蟲和病原菌均有效方能取得良好的防治效果，因?yàn)榈兔芏鹊木€蟲或病原菌均可導(dǎo)致復(fù)合病害的發(fā)生和流行(Saeed IAM, MacGuidwin AE, Rouse DI. 1998. Effect of initial nematode population density on the interaction of Pratylenchus penetrans and Verticillium dahliae on iRusset Burbank’ potato. Journal of Nematology, 30，100 - 107) ;二是所需的化學(xué)農(nóng)藥劑量增加，如防治由棉花根黑腐病菌(7 basi)和南方根結(jié)線蟲(i￡ incogniia)在棉花上引起的復(fù)合病害需要施用的化學(xué)農(nóng)藥劑量比控制單一的根結(jié)線蟲病所需的劑量要高出30 — 50%(Wheeler TA，Hake KD, Dever JKj 2000. Survey of Meloidogyne incognita and Thi ela vi op sis basicola: their impact on cotton fruiting and producers management choices in infested fields. Journal of Nematology, 32，576 - 83)。目前，從植物中篩選具有雙抗功能的抗性基因并通過分子育種獲得雙抗品種是有效策略之一(Prabhu RRj Njiti VNj Bell-Johnson B. 1999. Selecting soybean cultivars for dual resistance to soybean cyst nematodeand sudden death syndrome using two DNA markers. Crop Science, 39， 982-987);米用輪作、土壤暴曬等栽培措施對復(fù)合病害亦有一定的控制效果。而具有環(huán)境友好、人畜安全特點(diǎn)的生物防治被認(rèn)為是最有前景的防治措施之一。
近年來，圍繞根結(jié)線蟲病的生物防治在生防資源、生防機(jī)制及應(yīng)用方面均取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。巴氏桿菌屬iPasteuria)細(xì)菌中的A penetrans、P. ramose、P. thornei、 P. nishizawae、Ρ· usage等種類可專性寄生116屬323種病原線蟲'P· penetrans在美國、日本等國家已被開發(fā)成商品化生物殺線蟲劑并被廣泛應(yīng)用(Chen ZXj Dickson DW. 1998. Review of Pasteuria penetrans : biology, ecology, and biological control potential. Journal of Nematology, 130，313 - 340) 形成毒性伴胞晶體的蘇云金桿菌、 球形芽孢桿菌是另一類重要的線蟲生防資源，特別是以線蟲為靶標(biāo)的漢thuringiensis 晶體蛋白(crystal protein)被確定后(Wei JZj Hale K，Carta Lj Platzer Ej et al. 2003. Bacillus thuringiensis crystal proteins that target nematodes. Proc Natl Acad Sci USA, 100(5)，2761-2765)，Bt制劑已廣泛用于線蟲病的防治。其它生防細(xì)菌，Brevibacillus Iaterosporus、Bacillus spp.可分泌蛋白酶等多種侵入酶破壞線蟲體壁并侵入線蟲體內(nèi)(Huang XWj Tian BY, Zhang KQ. 2005. An extracellular protease from Bre vi bad Ilus laterosporus G4 without parasporal crystal can serve as a pathogenic factor in infection of nematodes. Research in Microbiology, 156，719 - 727)。Bacillus、Pseudomorms 等 29 個(gè)屬的根際細(xì)菌(rhizobacteria)， Methylobacterium esteraomaticum^ Klebsiella varians 等植物內(nèi)生細(xì)菌(endophytic bacteria)，以及spp.、Photorhabdus spp.等昆蟲病原線蟲內(nèi)生細(xì)菌作為線蟲的天敵微生物，可通過干擾線蟲與寄主植物的識別、營養(yǎng)競爭、促進(jìn)植物生長、誘導(dǎo)植物抗性、分泌侵入酶、抗生素和其它毒性物質(zhì)等方式控制線蟲(Tian By, Yang JKj Zhang KQ. 2007. Bacteria used in the biological control of plant-parasitic nematodes: populations, mechanisms of action, and future prospects. FEMS Microbiology Ecology, 61，197 - 213)。生防細(xì)菌可分泌2_庚酮等揮發(fā)物誘惑線蟲靠近并侵染線蟲，進(jìn)而分泌蛋白酶毒殺線蟲(Niu QHj Huang XWj Zhang KQ. 2010. A Trojan horse mechanism of bacterial pathogenesis against nematodes. Proc Natl Acad Sci USA, 107(38)， 16411-16412)。
針對煙草黑腔病的生物防治也有諸多報(bào)道。BaciIIus、Pseudomonas、 Agrobacterium等屬的多種細(xì)菌可通過產(chǎn)生抗生素消解煙草疫霉菌的菌絲、孢子囊及游動(dòng)抱子(Broadbent P，Baker KFj Waterworth Y. 1971. Bacteria and actinomyctes antagonistic to fungal root pathogens in Australian soil. Aust J Biol Scij 24， 925-944)。在煙草根際建立生防菌種群有助于降低煙草疫霉的侵染，進(jìn)而減少煙草黑脛病的發(fā)生(English JTj Mitchell DJ. 1988. Relationship between the development of root systems of tobacco and infection by Phytophthora parasitica var. nicotianae. Phytopathology, 78，1478- 1483)。娃酸鹽細(xì)菌能有效預(yù)防煙草黑腔病， 減緩該病的蔓延(趙秀香，陳華民，吳元華.2007.硅酸鹽細(xì)菌B925對煙草黑脛病菌的抑制作用及其16S rDNA序列分析.煙草科技，3，56-60)。利用煙草內(nèi)生菌漢subtil is Itb57菌株對煙草黑脛病的田間防效在61. 25-72. 49%之間，與化學(xué)農(nóng)藥甲霜錳鋅相當(dāng)(馬4冠華，周常勇，肖崇剛.2010.煙草內(nèi)生細(xì)菌Itb57的鑒定及其對煙草黑脛病的防治效果.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，37(2)，148-152)。本項(xiàng)目組在煙草內(nèi)生生防菌的研究中，從煙草品種NC297不同生長時(shí)期的煙葉中篩選出165株煙草疫霉拮抗菌，這些生防細(xì)菌分別歸于 6 個(gè)屬-Jiaci Ilus, Bre vi bad Ilus, Streptomyces，Stenotrophomonas，Enhydrobac te, Erwinia (馮云利,奚家勤，馬莉,莫明和，方敦煌,夏振遠(yuǎn),雷麗萍,楊發(fā)祥,周峰.烤煙品種NC297內(nèi)生細(xì)菌中拮抗煙草黑脛病的生防菌篩選及種群組成分析.云南大學(xué)學(xué)報(bào)， 33 (4)，488-496)。生防菌對煙草疫霉的拮抗機(jī)制主要通過產(chǎn)生抗生素、抗菌肽、誘導(dǎo)抗性、 營養(yǎng)競爭、空間競爭等方式。
如上所述，分別針對根結(jié)線蟲和煙草疫霉的生物防治均有深入研究；然而，針對這兩種病原復(fù)合病害的生物防治報(bào)道很少。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種同時(shí)抗煙草黑脛病菌和根結(jié)線蟲病及其應(yīng)用方法。
芽抱桿菌amyloliquefaciensZY-9-13菌株系本專利申請人從烤煙新鮮葉片中分離、鑒定的一種煙草內(nèi)生細(xì)菌。該微生物通過抑制煙草黑脛病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)，在煙草根際有很好的定殖能力，微生物對煙草根結(jié)線蟲的生防特性和效果未公開報(bào)道。本發(fā)明從煙草內(nèi)生菌中篩選具有工業(yè)化生產(chǎn)前景的菌株，為煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中根結(jié)線蟲_煙草疫霉復(fù)合侵染的防治提供一種具有較好防治效果的生防微生物。
本發(fā)明所用的兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌為芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensZY-9-13菌株,該菌株2012年05月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏號=CGMCC No. 6162。分類命名解淀粉芽孢桿菌，拉丁文名稱=Bacillus amyloliquefaciensο
所述的ZY-9-13菌株的16S rRNA基因的序列共1435 bp(見后附序列表Λ序列號為HQ662602。結(jié)合形態(tài)特征，生理生化特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將ΖΥ-9-13菌株鑒定為 Bacillus amyloli quefaci ens 0菌株的16S rRNA基因序列(此序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列號為HQ662602)是鑒別該菌株的主要特征依據(jù)。 ZY-9-13菌株的最適宜的培養(yǎng)條件為KMB 培養(yǎng)基(葡萄糖 30. O g，蛋白胨 20. O g，MgSO4 ·7Η20 1.5 g，KH2PO4 I. 5g，蒸餾水1000 ml),pH 7. 0，接種量3%，培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時(shí)間42 h。在此條件下?lián)u瓶培養(yǎng)時(shí)其生物量可達(dá)I. 48 X IO9 cfu/ml。
利用本發(fā)明的ZY-9-13菌株可用于制備可兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的菌劑，該菌劑為可濕性粉劑，制備ZY-9-13可濕性粉劑時(shí)，適宜的載體、分散劑、潤濕劑、紫外保護(hù)劑和粘附劑分別為硅藻土、木鈉、十二烷基硫酸鈉、海藻酸鈉、蔗糖。
ZY-9-13可濕性粉劑的具體配方如下ZY-9-13原粉ΖΥ_9_13原粉擴(kuò)11%，木鈉 5 7%，十二烷基硫酸鈉0. 3 O. 6%，海藻酸鈉0. 7 I. 4%，蔗糖0. 8 I. 2%，硅藻土 80 84%。
此菌劑的活菌數(shù)6. 41 X IO9 cfu/g、含水量6. 3%、懸浮率71. 1%、細(xì)度99. 6%過400 目篩、濕潤時(shí)間18 S，符合微生物農(nóng)藥國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 20287-2006)。ZY-9-13原粉在4°C、 室溫、30°C 下存放 6 個(gè)月，活菌數(shù)由 6. 62X IO10 cfu/g 降至 5. 42X IO10 cfu/g、5. 21 X 101。cfu/g、4· 96X IO10 cfu/g ；ZY-9-13可濕性粉劑在4°C、室溫、30°C下存放6個(gè)月，活菌數(shù)由6.41 X IO9 cfu/g 降至 5. IXlO9 cfu/g,4. 71 X IO9 cfu/g,4. 26 X IO9 cfu/g。4°C為原粉及其可濕性粉劑的最佳存儲溫度。
本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于利用ZY-9-13菌株制備的可濕性粉劑對防治煙草根結(jié)線蟲及黑脛病菌病有很好的防治效果。能用于漂浮育苗基質(zhì)處理，移栽期和成熟期。施用時(shí)可將ZY-9-13菌劑與煙草育苗基質(zhì)混合使用，也可在移栽時(shí)施入煙草根際周圍，或在成熟期兌水灌根。對病害發(fā)生嚴(yán)重田塊，移栽期和成熟期分別施用一次效果最好。
利用ZY-9-13菌株制備的生防菌劑具有成本低、防效高、無殘留、對人畜安全的特點(diǎn)，是煙草農(nóng)業(yè)種植中防治煙草根結(jié)線蟲_黑脛病復(fù)合侵染的高效生物農(nóng)藥。
具體實(shí)施例方式I.本發(fā)明中ZY-9-13菌株的培養(yǎng)及菌劑制備ZY-9-13菌株試管斜面種子培養(yǎng)將該菌株的菌體接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面上，15-40°C下培養(yǎng)1-5天后獲得斜面種子，適宜的培養(yǎng)條件是37°C下培養(yǎng)2天。
ZY-9-13菌株液體種子的培養(yǎng)從劃線培養(yǎng)的平板上取一環(huán)ZY-9-13菌體接到Y(jié)SP 培養(yǎng)液中，36°C，150 rpm培養(yǎng)24 h后作為種子。
ZY-9-13菌株可濕性粉劑的制備在50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)紅霉素抗性標(biāo)記的 ZY-9-13菌株(ZY-9-13紅霉素抗性標(biāo)記菌株由本實(shí)驗(yàn)室提供)，發(fā)酵條件為30°C、轉(zhuǎn)速200 rpm、通氣率為O. 8、時(shí)間為42 h。發(fā)酵結(jié)束后用超濾系統(tǒng)將發(fā)酵液濃縮至原有體積的1/5。 然后將濃縮液于保鮮薄膜上攤開并在室內(nèi)涼干，將ZY-9-13菌劑原粉與木鈉、十二烷基硫酸鈉、海藻酸鈉、蔗糖和硅藻土按照20 11 I 2 2 164混勻，最后得到ZY-9-13 菌株可濕性粉劑。
再用攪碎機(jī)粉碎成原粉。用常規(guī)的稀釋平板涂布法計(jì)算單位重量原粉中的活性數(shù) (cfu/g)。將5 g原粉于120°C下烘烤I min后取稱重,計(jì)算原粉含水量。
含水量(%)=(初始重量-烘干重量)+初始重量X 100%。
2. ZY-9-13菌株可濕性粉劑防治煙草根結(jié)線蟲及黑脛病菌復(fù)合侵染的溫室試驗(yàn)供試菌劑活菌數(shù)為I X IO9個(gè)/g的ZY-9-13可濕性粉劑。
煙草品種K326。
供試病原材料煙草根結(jié)線蟲、煙草黑脛病菌。
試驗(yàn)方法烤煙常規(guī)漂浮育苗時(shí)，50 g ZY-9-13可濕性菌劑用300 ml水稀釋后與I kg育基質(zhì)混勻；陽性對照處理為58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑，58%甲霜靈錳鋅I g用300 ml水稀釋后與 I kg育基質(zhì)混勻；空白對照為300 ml水與I kg育基質(zhì)混勻。待煙苗長至5_6片葉子時(shí)， 在直徑為15 cm的、裝有500 g 土壤(沙土 腐殖土 =1:1)的每一花缽移栽一株煙苗，在煙根接種煙草根結(jié)線蟲和煙草黑脛病病原菌各5 ml，每處理三個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5盆。肥水管理按常規(guī)方法進(jìn)行，在室溫溫室內(nèi)生長90天后統(tǒng)計(jì)各處理的煙草黑脛病發(fā)病率及根結(jié)線蟲的發(fā)病率和根結(jié)指數(shù)，按以下公式計(jì)算發(fā)病率和防效發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)X 100%防效(％)=空白對照的發(fā)病率_藥劑處理的發(fā)病率根結(jié)指數(shù)=[Σ (各級植株數(shù)X級值)]+ (調(diào)查總株數(shù)X4) X 100 (方仲達(dá).2007.植病研究方法，第三版.中國農(nóng)業(yè)出版社，pp. 324-325)試驗(yàn)結(jié)果空白對照的發(fā)病率為87. 5%;甲霜靈錳鋅可濕性菌劑處理的發(fā)病率為 10. 8%，防效為76. 7% ；ZY-9-13可濕性菌劑處理的發(fā)病率為11. 3%，防效為76. 2%，與化學(xué)農(nóng)藥58%甲霜靈錳鋅可濕性菌劑的防治效果相當(dāng)。空白對照根結(jié)線蟲的發(fā)病率為100%，根結(jié)指數(shù)為91. 67。2￥-9-13可濕性粉劑處理的發(fā)病率為47. 5%，根結(jié)指數(shù)為41. 35，與對照比較， 發(fā)病率下降52. 5%，根結(jié)指數(shù)下降50. 12，顯示出ΖΥ-71-1對煙草根結(jié)線蟲病良好的防治效果ο
權(quán)利要求
1.一種兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌，其特征在于所用的煙草內(nèi)生菌為芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciensZY-9-13菌株,該菌株2012年05月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 6162。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌，其特征在于所述的ZY-9-13菌株的16S rRNA基因的序列共1435 bp，序列號為HQ662602。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌，其特征在于所述的ZY-9-13菌株的最佳培養(yǎng)條件為KMB培養(yǎng)基，pH 7. 0，接種量3%，培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時(shí)間 42 ho
4.一種如權(quán)利要求I所述的兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌的應(yīng)用，其特征在于所述菌株ZY-9-13作為制備兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的菌劑的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌的應(yīng)用，其特征在于兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的菌劑為可濕性粉劑，是由以下重量百分比組分配制而成，ZY-9-13原粉ZY-9-13原粉:9 11%，木鈉:5 7%，十二烷基硫酸鈉0. 3 O. 6%，海藻酸鈉O.7 I. 4%，蔗糖0. 8 I. 2%，硅藻土 80 84%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌的應(yīng)用，其特征在于所述菌劑的活菌數(shù)6. 41 X IO9 cfu/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及兼抗根結(jié)線蟲和煙草疫霉的煙草內(nèi)生菌及其應(yīng)用，其特征在于所用的生防微生物為芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensZY-9-13菌株，該菌株2012年05月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.6162。菌株的16SrRNA基因序列(此序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列號為JF731241)是鑒別該菌株的主要特征依據(jù)。本發(fā)明的微生物菌體及其代謝產(chǎn)物，能與農(nóng)藥常規(guī)吸附載體和助劑制成ZY-9-13可濕性粉劑生防菌劑。該菌劑對煙草根結(jié)線蟲-煙草黑脛病菌復(fù)合侵染有很好的防治效果。本發(fā)明的生防菌劑具有成本低、防效高、無殘留、對人畜安全的特點(diǎn)，是防治煙草根結(jié)線蟲-黑脛病復(fù)合侵染的高效生物農(nóng)藥。
文檔編號C12R1/07GK102925393SQ20121044049
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者奚家勤, 尹啟生, 宋紀(jì)真, 鄧賓玲, 薛超群, 石秋環(huán), 王廣山, 周漢平, 郭建華, 王建偉, 高志強(qiáng), 李永濤, 張仕祥, 孔德輝 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院