專利名稱：從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法
技術領域：
本發明涉及一種用于從造血器官、血液標本中獲得干細胞的細胞處理試劑盒及其應用方法。
背景技術：
成體干細胞是另外一類具有修復、再生、替代能力的未分化細胞類型，通常位于特定的小生境內，在受到外界損傷后，其會動員或者產生新的干細胞，通過增殖、分化的方式形成新的功能細胞，從而調節組織和器官細胞數量保持動態平衡。成體干細胞的多能性特點首先在骨髓中得到的成體干細胞得以發現。造血干細胞是目前研究的最為詳盡的成體干細胞之一，在過去近40年里一直是干細胞領域研究的主題，它們在體內進行自我更新的細胞分裂，在單細胞水平分化為所有的造血成份，并在機能上使得重度骨髓抑制的動物和人的骨髓得以恢復。目前，人們的研究發現造血干細胞主要來自于骨髓、臍帶血、外周血、經血，造血干細胞已被用于移植治療多種血液病、糖尿病及并發癥、某些惡性實體腫瘤、免疫缺陷等疾病的有效措施之一。動物實驗及臨床應用方面已證明造血干細胞移植對重建或改善骨髓造血功能有較好療效。干細胞在臍帶血的比例相對比較高，約1.5%左右，骨髓中的比例非常低，約0.1 0.5%，而造血干細胞在外周血中的比例更低，研究者采用多個分子表面標志，如使用Thy-Ι1 或FLK2_Lineage_Sca-l+c_Kit+可用于分選出造血干細胞群(ChristemsenJL 等，PNAS,2001.98:14541-14546 ;Uchida N 等，Experimental hematology,1996.24:649-659)，用⑶14+免疫磁性分離的方法從外周血篩選新的干細胞群(PCT/055950干細胞的提純、識別及用途)；采用⑶34、⑶133作為造血干細胞的標志物用于識別及分選造血干細胞或祖細胞(Civin 等，J Tmmunol 1984 ; 133:157-165 ;Kobari L 等，J HematotherStem Cell Res.2001 ; 10:273-281)。又有研究者發現分化程度較低的干/祖細胞通常表達一些ATP結合轉運蛋白(ATP-binding cassette，ABC)，細胞常利用ATP能量把外來的有毒物質從細胞內排出，以達到保護自身的目的，被稱為側群篩選法(side population,SP) ο 早期 Goodell 等(Goodell 等，J Exp Med, 1996.183 (4): 1796-1806)研究發現，當用H0echst33342對骨髓細胞進行染色后，造血干細胞具有很強的排出染液的能力。然而，最近的證據表明，⑶34在細胞膜上的表達不總是與干細胞活性相關，已有研究發現在人中獲得的干細胞缺乏CD34表達，但具有完全的重建能力的高度靜止的干細胞群體(Dao等，Leukemia 2000 ；14:773-776)，進一步顯示，與缺乏這些表型標志物的成體骨髓和臍帶血來源的干細胞相比，造血祖細胞的多能分化潛能有限(Jiang YY等，Nat CellBiol.2004 ；6:532-539),而側群篩選法雖然有其價值，但不足之處是，實驗重復性比較差，當從實體組織中篩選出SP細胞后，由于獲得活細胞的能力有限，當此類細胞進行移植后可能影響他們的重塑能力。
因此，人們一直關注發現其他方法，以替代或補充現有的分離富集干細胞和原始祖細胞的群體。
如申請號為CN200610114475.9的中國專利，提供了一種用于分離骨髓單個核細胞的試劑盒，雖然該試劑盒使用方便，成本低廉的優點，但其缺點在于:分離的干細胞其數量極少不足以臨床有效治療使用。申請號為CN200610106875.5的中國專利，提供了一種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法及申請號為200810089682.2的中國專利，提供了一種分離單個核細胞的方法和裝置，但經此分離后的細胞絕大多數為淋巴細胞，這樣導致細胞中實際能用于治療的干細胞占少數，極大的影響臨床療效，增加患者的經濟負擔。再如申請號為CN200710137781.9的中國專利，提供了一種骨髓臍帶血干細胞體外分離試劑盒及其應用方法，其缺點在于使用雞尾酒Iin抗體，導致成本大幅度增加，一方面增加患者的經濟負擔，使其難于接受細胞治療，且Iin抗體給隨后的細胞洗滌帶來了困難，很難確定其治療后在人體內發生的變化。上述分離方法得到包括所有譜系和階段的造血干和祖細胞和一些晚期前體細胞的干和祖細胞的混合細胞群體，我們定義為“一鍋粥”分選法，且干細胞的有效數量很低，這是不利的，因為已顯示僅分離CD34+細胞群體中最原始的細胞是有價值的(AskenasyN.等，Current Stem Cell Research and Therapy2006 ；1:85-94)。另外一個不足方面在于缺少可靠的特異性分子標記物對其進行識別。這些分離的細胞群并不是同質類型的，而是由許多不同分化狀態或增殖能力的混合細胞群組成，非常不純。有鑒于此，特提出本發明。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中所存在的缺點，為了克服上述方法上的不足及提供進一步相關的優點，本發明所提 供的一種用于從嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的造血器官、血液標本中獲得干細胞的細胞處理試劑盒及其應用方法，具有使用方便、易操作、可工業化生產、實用有效的優點，應用前景廣泛。本發明提供一種用于從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，包括盒體、試劑及使用說明書，其中，所述試劑盒(I)包括細胞前處理試劑A、細胞負向選擇試劑B、細胞正向選擇試劑C，分別盛放于細胞前處理試劑瓶(2)、細胞負向選擇試劑瓶(3)、細胞正向選擇試劑瓶(4)內，所述細胞負向選擇試劑瓶(3)中包含的試劑為化療藥物，細胞正向選擇試劑瓶(4)中包含的試劑為凝集素結合物。其中，所述細胞前處理試劑瓶(2)包含的試劑為紅細胞沉淀劑或紅細胞裂解液；紅細胞沉淀劑為質量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；紅細胞裂解液可選擇為氯化銨紅細胞裂解液、質量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；細胞前處理試劑A或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，所述細胞前處理試劑A作用細胞的次數至少為一次。其中，細胞負向選擇試劑瓶(3)中的化療藥物可選擇為包括抗生素化療藥物、抗代謝化療藥物、烷化劑化療藥物、激素及內分泌化療藥物、植物化療藥物、亞硝脲類化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、甲基芐肼、草酸鉬、鉬類、丙亞胺、羥基脲和氨烯咪胺的一種或兩種以上的組合。其中，所述細胞負向選擇試劑瓶(3)中試劑接觸細胞的時間為小于或等于120小時。
其中，細胞正向選擇試劑瓶(4)中所述凝集素可選擇為天然的或人工合成的植物凝集素、動物凝集素及其衍生物的一種或兩種以上的組合，進一步，所述凝集素的濃度為
0.001 30mg/ml。其中，所述細胞正向選擇試劑瓶中所述凝集素的結合物可選擇預先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進行結合，形成凝集素結合物。其中，所述熒光染料可選擇為異硫氰酸熒光素(FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、藻紅蛋白(PE)、Cy系列花菁染料、ef 1ur系列、FL系列、Alexa Flour系列、Alexa、多甲藻黃素葉綠素蛋白(PerCP)及別藻青蛋白(APC)系列的任一一種。其中，所述與凝集素結合的聞分子量的生物大分子的分子量在10000道爾頓(Mw)以上。其中，所述高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。其中，所述細胞正向選擇試劑瓶中試劑接觸細胞的時間小于或等于120分鐘，與細胞孵育的溫度選擇為小于或等于38°C。本發明還提供一種試劑盒的應用方法，其包括以下步驟:(a)所述細胞樣本與細胞前處理試劑A接觸:如加入紅細胞沉淀劑，選擇取上清；如加入紅細胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細胞沉淀；
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(b)使經過步驟(a)的所述細胞群與所述細胞負向選擇試劑B接觸，接觸時間小于或等于120小時；(C)將步驟(b)所得的液體離心，丟棄上清取下層細胞沉淀，之后，用常規緩沖液洗滌細胞；(d)重復步驟(C)兩到三次；(e)使經過步驟(d)的所述細胞群與所述細胞正向選擇試劑C接觸，所述凝集素的濃度為0.001 30mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C ；(f)分離獲得凝集素陽性的細胞群:可選擇采用熒光活化細胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法；其中，根據本發明的方法或試劑盒獲得的所述細胞群隨后加入盛放于細胞洗滌試劑瓶(5)內的洗脫糖細胞洗滌劑D用于把所述凝集素結合物從所述獲得的細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。其中，所述細胞來源于嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的造血器官、血液標本，進一步，所述造血器官、血液選自嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的骨髓、脾臟、胸腺、胎肝、夕卜周血、臍帶血、卵黃囊、胸腺、淋巴結、胸膜及其滲出液樣品。進一步，根據本發明的試劑收集獲得的干細胞作為基礎、臨床與應用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復失去功能的病變組織或器官中的應用。
圖1用于從造血器官、血液標本中獲得干細胞的細胞處理試劑盒組成該圖表明了從造血器官、血液標本中獲得干細胞的細胞處理試劑盒的組成，它由試劑瓶、試劑、盒體組成。所述試劑盒(I)包括細胞前處理試劑A、細胞負向選擇試劑B、細胞正向選擇試劑C，分別盛放于細胞前處理試劑瓶(2)、細胞負向選擇試劑瓶(3)、細胞正向選擇試劑瓶(4)內，所述細胞負向選擇試劑瓶(3)中包含的試劑為化療藥物，細胞正向選擇試劑瓶(4)中包含的試劑為凝集素結合物。進一步，試劑盒還可包括洗脫糖細胞洗滌試劑D，盛放于細胞洗滌試劑瓶(5)內。試劑瓶的封閉蓋分別為(6)、(7)、(8)、(9)，可選擇為壓力、螺絲或其他。
具體實施例方式實施例1本發明的用于從骨髓標本中獲得干細胞的細胞處理試劑盒，它由試劑瓶、試劑、盒體組成。所述試劑盒(I)包括細胞前處理試劑A、細胞負向選擇試劑B、細胞正向選擇試劑C，所述細胞前處理試劑A為質量濃度為I 6%的明膠，細胞負向選擇試劑B為氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡鉬，細胞正向選擇試劑C為植物凝集素及其結合物，分別盛放于細胞前處理試劑瓶(2)、細胞負向選擇試劑瓶(3)、細胞正向選擇試劑(4)內，進一步，所述凝集素為雙花扁豆凝集素(DBA)和花生凝集素(PNA)，所述結合物為牛血清白蛋白(BSA)。其中，所述試劑盒(I)還可包括洗脫糖細胞洗滌試劑D，盛放于細胞洗滌試劑瓶(5)內，所述洗脫糖為N-乙酰半乳糖胺、半乳糖。進一步，所述試劑瓶的封閉蓋(6)、(7)選擇為壓力，試劑瓶的封閉蓋⑶和(9)選擇為螺絲。其中，細胞負向選擇試劑瓶(3)中化療藥物接觸骨髓細胞的時間為96小時。其中，所述細胞 正向選擇試劑瓶(4)中所述凝集素的濃度為5mg/ml。進一步，與所述細胞接觸的時間為20分鐘，孵育的溫度為37°C。進一步，吸取下層沉淀的細胞群，所述細胞再用生理鹽水進行洗滌。之后，加入細胞洗滌試劑瓶(5)中的試劑D，孵育30分鐘后，4°C條件下離心丟棄上清，再用生理鹽水進行重懸。所述獲得的細胞群不含任何外來標記。進一步，所述細胞群隨后加入半乳糖、N-乙酰半乳糖胺兩種洗脫糖細胞洗滌劑D用于把所述凝集素結合物從所述獲得的細胞上洗脫，從而使得獲得的造血干細胞不帶任何外來標記物。 進一步，所述試劑盒可作用的對象為嚙齒動物、人或其他哺乳動物的骨髓細胞群。其中，所述使用說明書用于說明從骨髓中收集獲得干細胞的使用方法。其中，整個操作過程保持在無菌工作環境中進行操作，其中，內毒素檢測含量(0.5EU/mL表示試劑盒合格。實施例2本發明的用于從臍帶血標本中獲得干細胞的細胞處理試劑盒，它由試劑瓶、試劑、盒體組成。所述試劑盒(I)包括細胞前處理試劑A、細胞負向選擇試劑B、細胞正向選擇試劑C，所述細胞前處理試劑A為質量濃度為4 8%的羥乙基淀粉，細胞負向選擇試劑B為氟尿嘧啶、紫杉醇、卡鉬，細胞正向選擇試劑C為植物凝集素及其結合物，分別盛放于細胞前處理試劑瓶(2)、細胞負向選擇試劑瓶(3)、細胞正向選擇試劑(4)內，進一步，所述凝集素為大豆凝集素(SBA)和荊豆凝集素(UEA)，所述結合物為熒光染料TRITC。進一步，所述試劑瓶的封閉蓋(6)和(7)選擇為壓力，試劑瓶的封閉蓋⑶、(9)選擇為螺絲。其中，細胞負向選擇試劑瓶(3)中化療藥物接觸臍帶血細胞的時間為36小時。其中，所述細胞正向選擇試劑瓶⑷中所述凝集素的濃度為0.95mg/ml。進一步，與所述細胞作用的時間為90分鐘,孵育的溫度為4°C。其中，所述細胞用PBS緩沖液進行洗滌。進一步，所述細胞洗滌后離心丟棄上清后用PBS緩沖液重懸細胞，之后，通過流式細胞儀進行分選。進一步，所述細胞群隨后加入半乳糖、海藻糖兩種洗脫糖細胞洗滌劑D用于把所述凝集素結合物從所述獲得的細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。進一步，所述試劑盒作用的對象為人源臍帶血細胞群。其中，所述使用說明書用于說明從臍帶血中收集獲得干細胞的使用方法。其中，整個操作過程保持在無菌工作環境中進行操作，其中，內毒素檢測含量(0.5EU/mL表示試劑盒合格。實施例3本發明的用于從脾臟標本中獲得造血干細胞的細胞處理試劑盒，它由試劑瓶、試齊U、盒體組成。所述試劑盒(I)包括細胞前處理試劑A、細胞負向選擇試劑B、細胞正向選擇試劑C，所述細胞前處理試劑A為質量濃度為3 12%的聚乙烯吡咯烷酮，細胞負向選擇試劑B為氮芥、門冬酰胺酶、甲基芐肼，細胞正向選擇試劑C為植物凝集素及其結合物，分別盛放于細胞前處理試劑瓶(2)、細胞負向選擇試劑瓶(3)、細胞正向選擇試劑(4)內，進一步，所述凝集素為荊豆凝集素(UEA)，所述結合物為熒光染料為磁珠。進一步，所述試劑瓶的封閉蓋(7)、(9)選擇為壓力，試劑瓶的封閉蓋(6)和⑶選擇為螺絲。其中，細胞負向選擇試劑瓶(3)中化療藥物接觸脾臟細胞的時間為12小時。其中，所述細胞正向選擇試劑瓶⑷中所述凝集素的濃度為12mg/ml。進一步，與所述細胞接觸的時間為45分鐘，孵育的溫度為4°C。其中，所述細胞用PBS緩沖液進行洗滌。進一步,所述細胞洗漆后離心丟棄上清后用PBS緩沖液重懸細胞,之后,通過專用磁柱進行分選。進一步，所述細胞群 隨后加入海藻糖這種洗脫糖細胞洗滌劑D用于把所述凝集素結合物從所述獲得的細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。進一步，所述試劑盒作用的對象為人類、嚙齒動物或其他哺乳動物的脾臟細胞群。其中，所述使用說明書用于說明從脾臟中收集獲得干細胞的使用方法。其中，整個操作過程保持在無菌工作環境中進行操作，其中，內毒素檢測含量(0.5EU/mL表示試劑盒合格。實施例4
本發明所述的試劑盒的應用方法，具體步驟如下:(a)所述骨髓細胞樣本與細胞前處理試劑A接觸:細胞前處理試劑A為質量濃度為I 6%的明膠,之后吸取上清；(b)使經過步驟(a)的所述細胞群與所述細胞負向選擇試劑B接觸:其中，所述細胞負向選擇試劑B為氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡鉬，接觸所述細胞的時間為96小時；(c)將步驟(b)所得的液體離心，丟棄上清取下層細胞沉淀，之后，用生理鹽水洗滌細胞；(d)重復步驟(C)兩到三次；(e)使經過步驟(d)的所述細胞群與所述細胞正向選擇試劑C接觸:所述試劑為雙花扁豆凝集素(DBA)和花生凝集素(PNA)，所述結合物為牛血清白蛋白(BSA)，所述凝集素的濃度為5mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為20分鐘，孵育溫度為37°C ；(f)分離獲得凝集素陽性的細胞群:選擇采用靜置沉淀法；最后，加入半乳糖、N-乙酰半乳糖胺兩種洗脫糖細胞洗滌劑D把所述凝集素結合物從所述獲得的細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。進一步，所述試劑盒應用的對象為人類、嚙齒動物或其他哺乳動物的骨髓標本來源的細胞群。其中，所述使用說明書用于說明從所述骨髓標本中收集獲得干細胞的使用方法。
實施例5本發明所述的試劑盒的應用方法，具體步驟如下:(a)所述臍帶血細胞樣本與細胞前處理試劑A接觸:細胞前處理試劑A為質量濃度為4 8%的羥乙基淀粉，之后吸取上清；(b)使經過步驟(a)的所述細胞群與所述細胞負向選擇試劑B接觸:其中，所述細胞負向選擇試劑B為氟尿嘧啶、紫杉醇、卡鉬，接觸所述細胞的時間為36小時；(c)將步驟(b)所得的液體離心，丟棄上清取下層細胞沉淀，之后，用PBS緩沖液洗滌細胞；(d)重復步驟(C)兩到三次；(e)使經過步驟(d)的所述細胞群與所述細胞正向選擇試劑C接觸:所述試劑為大豆凝集素(SBA)和荊豆凝集素(UEA)，所述結合物為熒光染料TRITC，所述凝集素的濃度為0.95mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為90分鐘，孵育溫度為4°C ；(f)分離獲得凝集素陽性的細胞群:選擇采用流式細胞儀分選法；最后，加入半乳糖、海藻糖兩種洗脫糖細胞洗滌劑D用于把所述凝集素結合物從所述獲得的細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。進一步，所述試劑盒應用的對象為人類臍帶血標本來源的細胞群。其中，所述使用說明書用于說明從所述臍帶血標本中收集獲得干細胞的使用方法。其中，整個操作過程保持在無菌工作環境中進行操作。顯然在不違反本發明的領域及范疇下，可以對上述用于從造血器官、血液標本中獲得干細胞的細胞處理試劑盒進行成分的修飾及或增加，本發明是以上述實施例進行試劑盒的說明，并不是用于限制試劑盒的使用，對此進行的任何等同替換、修改、增加均落在本發明的試劑盒的保護范疇內。`
權利要求
1.造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，包括盒體、試劑、試劑瓶及使用說明書，其特征在于，該試劑盒(I)包括細胞前處理試劑A、細胞負向選擇試劑B、細胞正向選擇試劑C，分別盛放于細胞前處理試劑瓶(2)、細胞負向選擇試劑瓶(3)、細胞正向選擇試劑瓶(4)內，所述細胞負向選擇試劑瓶(3)中包含的試劑為化療藥物，細胞正向選擇試劑瓶(4)中包含的試劑為凝集素結合物。
2.根據權利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，細胞前處理試劑瓶(2)包含的試劑為紅細胞沉淀劑或紅細胞裂解液；紅細胞沉淀劑為質量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；紅細胞裂解液可選擇為氯化銨紅細胞裂解液、質量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；細胞前處理試劑或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，所述細胞前處理試劑A作用細胞的次數至少為一次。
3.根據權利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，細胞負向選擇試劑瓶(3)中的化療藥物可選擇為包括抗生素化療藥物、抗代謝化療藥物、烷化劑化療藥物、激素及內分泌化療藥物、植物化療藥物、亞硝脲類化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、甲基芐肼、草酸鉬、鉬類、丙亞胺、羥基脲和氨烯咪胺的一種或兩種以上的組合。
4.根據權利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，細胞負向選擇試劑瓶(3)中試劑接觸細胞的時間為小于或等于120小時。
5.根據權利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，細胞正向選擇試劑瓶(4)中所述凝集素可選擇為天然的或人工合成的植物凝集素、動物凝集素及其衍生物的一 種或兩種以上的組合，所述凝集素的濃度為0.001 30mg/ml ο
6.根據權利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，細胞提純試劑瓶中所述凝集素的結合物可選擇預先與熒光素、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進行結合。
7.根據權利要求6所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，所述與凝集素結合的高分子量的生物大分子的分子量在10000道爾頓(Mw)以上。
8.根據權利要求7所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。
9.根據權利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，所述細胞提純試劑瓶中試劑接觸細胞的時間小于或等于120分鐘，與細胞孵育的溫度選擇為小于或等于38°C。
10.根據權利要求1所述的試劑盒的應用方法，其特征在于，其應用方法包括以下步驟: (a)所述細胞樣本與細胞前處理試劑A接觸:如加入紅細胞沉淀劑,選擇取上清；如力口入紅細胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細胞沉淀； (b)使經過步驟(a)的所述細胞群與所述細胞負向選擇試劑B接觸，接觸時間小于或等于120小時； (c)將步驟(b)所得的液體離心，丟棄上清取下層細胞沉淀，之后，用常規緩沖液洗滌細胞； (d)重復步驟(c)兩到三次； (e)使經過步驟(d)的所述細胞群與所述細胞正向選擇試劑C接觸，所述凝集素的濃度為0.001 30mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于380C ； (f)分離獲得凝集素陽性的細胞群:可選擇采用熒光活化細胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法。
11.據權利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，加入盛放于細胞洗滌試劑瓶(5)內的洗脫糖細胞洗滌劑D把所述凝集素結合物從所述獲得的細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。
12.根據權利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，其特征在于，所述造血器官、血液選自嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的骨髓、脾臟、胸腺、胎肝、外周血、臍帶血、卵黃、胸腺、淋巴結、胸膜及其滲出液樣品，進一步，根據本發明的試劑收集獲得的干細胞作為基礎、臨床與應用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復失去功能的病變組織或器官中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種從造血器官、血液中獲得干細胞的試劑盒及其應用方法，包括試劑瓶、試劑、盛放試劑瓶的盒體及使用說明書，本發明的試劑盒(1)包括細胞前處理試劑A、細胞負向選擇試劑B、細胞正向選擇試劑C，分別盛放于細胞前處理試劑瓶(2)、細胞負向選擇試劑瓶(3)、細胞正向選擇試劑瓶(4)內。本發明的試劑盒還可包括洗脫糖細胞洗滌劑D，盛放于細胞洗滌試劑瓶(5)內，根據本發明獲得的干細胞可不帶任何外來標記，不僅可應用于實驗室研究，也可以直接用于臨床使用。本發明的試劑盒使用簡便、易操作、可工業化生產，實用有效，可直接用于人類及其他哺乳動物的來源的造血器官、血液標本中的干細胞獲得，應用前景廣泛。
文檔編號C12N5/071GK103087978SQ201210440078
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月26日 優先權日2011年10月28日
發明者盧磊磊, 李福生, 盧淼淼, 盧晶晶 申請人:盧磊磊, 李福生