專利名稱：巢式一步法rt-pcr從單個b細胞擴增鼠源抗體重鏈和輕鏈可變區基因全序列的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別涉及一種巢式一步法RT-PCR從單個B細胞擴增鼠源抗體重鏈和輕鏈可變區基因全序列的方法。
背景技術：
單克隆抗體藥物具有特異性強、副作用小等臨床優勢，抗體藥物直接與靶標結合，靶向特異性強，同時，抗體識別目標的靈敏度很高，用藥量少；再加上抗體藥物本身屬于蛋白質，其在體內代謝與其他內在抗體和蛋白質過程相同，不會額外對肝腎造成負擔，因而一般副作用很小，具有廣闊的應用前景，目前主要用于腫瘤、自身免疫等疾病的治療。抗體分子的基因結構較復雜，抗體的輕鏈L由C、V和J 3個基因簇編碼，抗體的重鏈H由C、V、D和J 4個基因簇編碼。V是抗體基因編碼可變區，人的Svh基因數量約為100個，D基因片段為10-20個，Jh基因片段有9個；小鼠Vh的基因片段的數目約為250-1000種，D基因片段有12個，Jh基因片段有4個；抗體輕鏈分為K和λ 2個亞型，正常人血清免疫球蛋白K鏈:λ鏈約為2:1，Vk基因的數量約為100個；而小鼠95%的抗體輕鏈是K型，小鼠Vk基因片段約有250個，這些基因片段通過多種多樣的重排，合成出的肽段再進一步進行L和H鏈組合，從而生成眾多的抗體種類。目前，人們已經開發出多種抗體藥物篩選的方法，如雜交瘤融合技術，噬菌體展示技術和酵母展示技術等。與傳統的雜交瘤融合技術相比，抗體的體外表達技術具有效率高，操作簡單，實 驗周期短等優點(Clackson T, Nature, (1991) 352:624-628; Boder E,Nature Biotechnol, (1997) 15:553-557)，其逐漸成為功能強大的抗體藥物開發工具。從單個B細胞中擴增得到抗體基因的Vh和\的全序列是其中的關鍵步驟。
發明內容
本發明的目的在于提供一種巢式一步RT-PCR從單個B細胞中擴增抗體基因重鏈可變區Vh和輕鏈可變區\的方法。本發明根據NCBI和VBASE的小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈的V基因序列設計兼并引物，可以特異性地擴增得到囊括所有V基因種類的DNA序列。然后通過特定的接頭DNA片段(Linker接頭)將重鏈和輕鏈的可變區基因序列連接在一起，再通過巢式PCR進行擴增，并帶入酶切位點，可以克隆到特定的雙向表達載體，進行真核表達。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
一種巢式一步法RT-PCR從單個B細胞擴增鼠源抗體重鏈和輕鏈可變區基因全序列的方法，所述的方法步驟如下:
(I)寡聚脫氧核糖核酸引物和接頭設計
根據NCBI和VBASE上已報道的小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈的V基因序列設計兼并引物，根據小鼠抗體重鏈和輕鏈的家族分類，重鏈可變區上游引物命名為VH1-VH13 (長度為41-46bp)，下游引物命名為CHl ;輕鏈可變區上游引物命名為VK1-VK19 (長度為41_46bp)，下游引物命名為CKl ;上述上游引物起始于小鼠重鏈和輕鏈可變區5’末端，下游引物終止于小鼠重鏈和輕鏈的恒定區；重鏈可變區上游引物和輕鏈可變區上游引物的5’端分別帶入linker接頭，重鏈可變區上游引物帶入的linker接頭和輕鏈可變區上游引物帶入的linker接頭互補；
重鏈可變區上游引物和輕鏈可變區上游引物的5’端分別帶入的linker接頭序列如
下:
重鏈 linker:5，-TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA~3，
輕鏈 linker:5，-QGCGCGCkkQCTKCGGCCGkTQT- ,，；
加粗斜體標注部分為加入的Eag I和BssH II的酶切位點，下劃線所示為重鏈linker與輕鏈linker的互補區。(2)—步法 RT-PCR
以單個B cell為模板通過逆轉錄酶將重鏈、輕鏈可變區基因的mRNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，重鏈可變區上游引物VH1-VH13，下游引物CHl和輕鏈可變區上游引物VK1-VK19，下游引物CKl為引物，擴增出重鏈、輕鏈可變區基因；擴增出重鏈和輕鏈可變區基因的上游引物帶入互補的Linker接頭，通過PCR產物的退火互搭，重鏈和輕鏈的可變區基因連接在一起，形成V11-1inker-VL的DNA片段。(3)巢式 PCR
以VirIinker-'的DNA片段為模板，采用巢式PCR進行擴增，擴增得到可以連接到雙向表達載體中的V11-1inker-'的PCR產物。
重鏈可變區上游引物及下游引物的序列如下:
權利要求
1.一種巢式一步法RT-PCR從單個B細胞擴增鼠源抗體重鏈和輕鏈可變區基因全序列的方法，其特征在于:所述的方法步驟如下: (O寡聚脫氧核糖核酸引物和接頭設計 根據NCBI和VBASE上已報道的小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈的V基因序列設計兼并引物，根據小鼠抗體重鏈和輕鏈的家族分類，重鏈可變區上游引物命名為VH1-VH13，下游引物命名為CHl ;輕鏈可變區上游引物命名為VK1-VK19，下游引物命名為CKl ;上述上游引物起始于小鼠重鏈和輕鏈可變區5’末端，下游引物終止于小鼠重鏈和輕鏈的恒定區；重鏈可變區上游引物和輕鏈可變區上游引物的5’端分別帶入linker接頭，重鏈可變區上游引物帶入的linker接頭和輕鏈可變區上游引物帶入的linker接頭互補； 重鏈可變區上游引物和輕鏈可變區上游引物的5’端分別帶入的linker接頭序列如下:重鏈 linker:5，-TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA-3’輕鏈 linker:5，-GGCGCGCAAGCTACGGCCGATGT-3，； (2)一步法 RT-PCR 以單個B cell為模板通過逆轉錄酶將重鏈、輕鏈可變區基因的mRNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，重鏈可變區上游引物VH1-VH13，下游引物CHl和輕鏈可變區上游引物VK1-VK19，下游引物CKl為引物，擴增出重鏈、輕鏈可變區基因；擴增出重鏈和輕鏈可變區基因的上游引物帶入互補的Linker接頭，通過PCR產物的退火互搭，重鏈和輕鏈的可變區基因連接在一起，形成V11-1inker-VL的DNA片段； (3)巢式PCR 以VirIinker-'的DNA片段為模板，采用巢式PCR進行擴增，擴增得到可以連接到雙向表達載體中的V11-1inker-'的PCR產物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述linker接頭內包含EagI和BssH II的酶切位點。
3.根據權利要求1或2所述 的方法，其特征在于:步驟(3)中巢式PCR使用的引物兩端帶入了 Sfil的酶切位點。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，目的在于提供一種巢式一步法RT-PCR從單個B細胞擴增鼠源抗體重鏈和輕鏈可變區基因全序列的方法。本發明根據NCBI和VBASE的小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈的V基因序列設計兼并引物，可以特異性地擴增得到囊括所有V基因種類的DNA序列。然后通過特定的接頭DNA片段(Linker接頭)將重鏈和輕鏈的可變區基因序列連接在一起，再通過巢式PCR進行擴增，并帶入酶切位點，可以克隆到特定的雙向表達載體，進行真核表達。本發明優點為覆蓋面廣，靈敏度高，效率高，通量大，步驟簡單，簡化勞動，降低成本，應用范圍廣，結果可靠。
文檔編號C12N15/10GK103074349SQ20121043881
公開日2013年5月1日 申請日期2012年11月7日 優先權日2012年11月7日
發明者張 成, 藥晨江, 景書謙 申請人:杭州鴻運華寧生物醫藥工程有限公司