專利名稱：一種抑制BMP15基因表達的siRNA 及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學以及生物工程技術領域，具體涉及水牛抑制骨形態發生蛋白15 (BMP15)基因表達的SiRNA片段。
背景技術：
1998年，華盛頓卡耐基研究院的AndrewFire和馬薩諸塞大學癌癥中心的 CraigMello 首次發現 RNA 干擾(RNA interference, RNAi), RNAi 是由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子引發的轉錄后基因沉默過程，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因表達的監控機制。RNAi是通過雙鏈RNA誘導與之同源的mRNA降解，導致目標基因轉錄后緘默的現象或機制。
siRNA是RNAi機制中最重要的發現。生物學研究證實，siRNA為3 '端突出
2-3nt，長為19-23 nt的雙鏈RNA，5'端為磷酸基，3'端為羥基，這種結構特點說明dsRNA被與RNaseIII相似的酶加工過。RNA干擾包括起始階段和效應階段(initiation andeffecting steps)。在起始階段,加入的雙鏈RNA被切割為21_23個核苷酸的小分子干擾RNA (small interfering RNAs, siRNA) 研究表明:Dicer 酶是 RNaseIII 家族中能特異識別雙鏈RNA的一種，它以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因、病毒感染等各種方式引入的dsRNA，將dsRNA降解為21bp左右的雙鏈RNA，每個片段的3'端都有2個堿基突出。在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄體上，mRNA與siRNA的反義鏈結合，置換出正義鏈，然后RISC上的核酸酶以一定的間隔，在被識別的2個核酸中間進行切割，以核酸內切酶作用方式對mRNA進行核酸內切割，導致mRNA降解。完成一次切割后，引導siRNA仍然結合在RISC中，繼續完成更多輪的切割。在線蟲和植物研究中發現，RdRP會以mRNA為模板，siRNA為引物，產生更多的dsRNA，進而將RNAi效應放大。目前siRNA的導入方式有三種，第一種是化學合成siRNAs轉染干擾，第二種是shRNA表達載體法，第三種是病毒載體法。慢病毒載體能在哺乳動物各類細胞穩定表達shRNA,長期抑制基因表達，被認為是目前活體RNAi的最佳載體。慢病毒載體介導的RNA干擾，就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNA干擾特異性抑制同源基因表達的作用相結合。2007年Singer等利用表達來源與聚合酶III啟動子的短發夾RNAs (shRNAs)慢病毒成功制備了轉基因敲除小鼠。BMP15最初是由Wozney于1988年首次分離到BMP15并成功克隆全cDNA。從氨基酸的序列看，BMP15和其它的BMPs—樣屬于轉移生長因子P (transforming growthfactor ^ , TGFP )超家族成員。許多研究表明，BMP15與很多BMPs —樣在動物的生殖調節中發揮著重要的作用。BMP15是一種在卵巢表達的卵母細胞衍生因子，在正常情況下主要與卵巢自身產生的⑶F9協調作用于卵泡，以自分泌或旁分泌形式影響優勢卵泡的發育及卵母細胞的生長。BMP15是嚙齒類動物、羊和人卵泡發育過程中必不可少的調節因子，而且還參與調節綿羊排卵率。另外，BMP15除在卵母細胞的特異表達，還在哺乳動物其它組織表達。Otsuka等報道，小鼠的垂體中發現有BMP15的表達。Aahonen等報道，在人睪丸中有BMP15的表達。Pennetier等利用RT- PCR技術證實了 BMP15在牛睪丸中有表達。Faure等報道，人的垂體、子宮和骨髓都有BMP15的表達。何小龍等的研究表明，BMP15基因能夠在蒙古牛卵巢、輸卵管、子宮和腎臟組織中表達，并且在卵巢和輸卵管中高度表達，而在子宮和腎臟組織中表達水平不是很高。因此，BMP15在調節哺乳動物生殖方面可能起著多重的調節作用。siRNA作為一種新型的基因工具來抑制特定基因的表達，目前大規模應用于生物細胞、組織和個體，均取得了不同程度的預期效果。但對于水牛骨形態發生蛋白15的siRNA還未見研究報道。
發明內容
本發明的目的在于通過下調BMP15基因的部分功能來提高水牛的繁殖率，由于水牛繁殖率普遍較低，本發明提供了一種抑制水牛骨形態發生蛋白15 (簡稱BMP15)基因表達 的 siRNA。本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種抑制水牛骨形態發生蛋白15 (簡稱BMP15)基因表達的siRNA，分別命名為BMP15-1、BMP15-2和BMP15-3，其核苷酸雙鏈中正義鏈序列如下
BMP15-1 SEQ ID NO:I ；
BMP15-2 SEQ ID NO:2 ；
BMP15-3 SEQ ID NO:3。所述siRNA與BMP15基因mRNA反向互補，其長度為19 27bp。含有上述siRNA 的 shRNA。 上述shRNA，兩端帶有I和I酶切位點的序列，便于構建表達質粒，雙鏈核苷酸序列如下
BMP15-ldsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；
BMP15-2dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列；
BMP15-3dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDN0:9所示的核苷酸序列。一種表達載體，由上述shRNA的編碼基因與出發載體構建的，即將shRNA編碼基因插入出發載體上構建而成。慢病毒載體可以直接高效率地感染分裂期和非分裂期細胞，且轉染效果更加穩定，作為上述出發載體中的優選方案，其中病毒載體最優選pshRNA-copGFP Lentivector0該載體具有完整的shRNA插入位點以及綠色突光蛋白(green fluorescence protein,GFP)報告基因，實現了靶基因shRNA的高效表達、病毒包裝以及轉基因的直觀展示。本發明的siRNA可以制備成基因藥物或其他合適的制劑用于下調水牛骨形態發生蛋白15的表達，從而提聞水牛的繁殖性能。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明的siRNA沉默效果好，能夠特異性的下調BMP15基因的表達。通過實時定量Real-time PCR檢測發現各干擾片段能使BMP15 mRNA表達量顯著降低，ELISA檢測BMP15蛋白表達量也相應降低。發明人構建了含有上述siRNA的編碼基因的pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質粒，并對其進行了體外細胞水平的實驗，并制備了轉基因小鼠模型，結果證明了pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質粒轉入細胞后能表達shRNA，并對BMP15基因進行特異性的抑制，從而在制備用于BMP15下調的生物制劑中有應用價值。
圖I. pcDNA3. I (+/-)載體圖 2. pPUC19-BMP15酶切電泳圖，M :DL15000 makeer，I :空質粒，2 :: BanR I 單酶切，3:Bam^ I/ BcoR I 雙酶切；
圖 3. pcDNA3. I (-)載體酶切圖，I -.BatrfA I/ I 雙酶切，2 -.BamR I 單酶切，3 :空 質粒，M 15000bp make ；
圖4.重組質粒pcDNA3. I- BMP15菌落鑒定電泳圖，箭頭所指BMP15基因擴增片段；
圖 5. pshRNA-copGFP Lentivector 載體圖 6. pshRNA-copGFP Lentivector 載體酶切圖，I :空質粒,2 -.BamW I 單酶切，3 -.BamWI/ I雙酶切；
圖7.退火產物鑒定電泳圖 8.重組質粒 Lv-shRNA 鑒定，I Lv-shRNAl, 2 Lv-shRNA2, 3 Lv-shRNA3, M 50bpmaker ；
圖9.細胞總RNA電泳檢驗 圖10.水牛pcDNA3. 1(-)_BMP15及LV-shRNA共轉染CHO細胞48h熒光顯微鏡圖(40X)；
圖11.慢病毒干擾質粒對水牛BMP15 mRNA表達水平的影響，其中*表示差異顯著0°< 0. 05)；
圖12.轉染空質粒和慢病毒質粒后CHO細胞裂解液中BMP15蛋白濃度變化，其中*表不差異顯著(/* < 0. 05)。
具體實施例方式以下結合具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述。實施例I構建p⑶NA3. I- BMP15真核表達載體
I.合成水牛骨形態發生蛋白15 (BMP15)序列(GenBank登錄號NM_001031752)，連接于載體PUC19上，酶切位點漢I / I。雙酶切(fcoR I與BamH I )和測序證明合成片段正確(見圖2)。2.構建pCDNA3. 1-BMP15真核表達質粒
(I)酶切反應
反應體系WcoR I與BamH I雙酶切PCR產物。BcoR I與BamH I雙酶切pcDNA3. I (-)，酶切體系10 X Buffer K 2 u L,EcoR I IuLjBamH I I y L，質粒 6 y L，蒸餾水 10 y L，總體積20iiL。反應條件37°C作用I. 2h，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。酶切產物用DNA純化試劑盒純化，最后各以30 ii L水洗脫DNA，-20°C保存。(2)連接反應
反應體系線性化pcDNA3. 1(-) 4m, IOXLigation Buffer 2ML，T4 DNA Ligase 1ML，BMP15目的片段13ML，總體積為20 u L。反應條件16°C連接過夜，獲得重組p⑶NA3. I-BMP15真核表達質粒。3.重組質粒轉化大腸桿菌
篩選步驟2中p⑶NA3. I-BMP15真核表達質粒的陽性克隆，通用引物(17和BGH)，序列號分別為SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11 ;擴增有IlOObp左右長度的插入片段釋放出者視為陽性重組體(見圖4)。從上述方法鑒定的陽性克隆中挑選2個克隆，接種于LA培養基中 制備新鮮菌液，經測序鑒定插入片段正確，構建p⑶NA3. 1-BMP15真核表達載體成功。實施例2構建pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質粒
I.根據水牛骨形態發生蛋白15的mRNA序列設計方法和原則篩選出靶序列，設計siRNA,與水牛骨形態發生蛋白15基因mRNA反向互補，分別命名為BMP15-1、BMP15-2,BMP15-3，其正義鏈序列如下
BMP 15-1 SEQ ID NO: I ；
BMP15-2 SEQ ID NO:2 ；
BMP15-3 SEQ ID NO:3。2.再根據siRNA靶序列設計構建抑制水牛骨形態發生蛋白15基因表達的siRNA載體所需的DNA序列BMP15 shRNA模板，兩端引入BamR I和I酶切位點，送上海生物工程技術服務有限公司合成。具體序列如下(F表示正義鏈，R表示反義鏈)
BMP 15-1 shRNA F SEQ ID NO: 4 ；
BMP 15-1 shRNA R SEQ ID NO: 5 ；
BMP15-2shRNA F SEQ ID NO:6 ；
BMP15-2shRNA R SEQ ID NO:7 ；
BMP15-3shRNA F SEQ ID NO:8 ；
BMP15-3shRNA R SEQ ID N0:9。3.將合成好的上述寡核苷酸序列溶解并稀釋至濃度為I Ug/yL，將上述6條序列分成 3 對，其中 BMP15-lshRNA F 和 BMP15_lshRNA R 為 I 對，BMP15-2shRNA F 和BMP15-2shRNA R 為 I 對，BMP15-3shRNA F 和 BMP15-3shRNA R 為 I 對。3 對序列分別進行退火反應。退火反應體系如下DNA模板單鏈I (BMP15-lshRNA F)lyl，DNA模板單鏈 2 (BMP 15-1 shRNA R) I yl，IOX 退火溶液 liil，ddH20 17u I0 反應條件混勻，95°C加熱IOmin ;室溫靜置I小時；稀釋至終濃度IOng/ill。-20°C備用。BMP15_2shRNA F和BMP 15-2 shRNA R，以及 BMP15_3shRNA F 和 BMPl 5_3 shRNA R 的退火反應體系同上，DNA 模板單鏈替換成相應核苷酸序列即可。4. LV-shRNA-GFP 空質粒載體(即 pshRNA-copGFP Lentivector 空質粒,見圖 6)酶切，酶切體系如下:漢3 H I I u I,BcoR I I u I, IOXBuffer K 2 y I，LV-shRNA-GFP空質粒6 U I, ddH20 10 yl。37°C作用lh，進行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果見圖6。博大泰克凝膠片斷回收純化試劑盒回收載體片段。將步驟3所得的退火產物與酶切質粒載體連接，連接體系如下雙酶切質粒LV-shRNA-GFP (0. I u g/u I) I u I，退火產物 I y 1，T4 DNA Ligase Buffer 2u I, T4 DNALigase I U I, ddH20 15u I0充分混勻，16 1水浴連接，反應過夜。5.轉化與陽性克隆的PCR鑒定轉化連接產物，挑取單個菌落，接種到LA液體培養基中，37°C恒溫振蕩培養3h。PCR鑒定陽性克隆，采用引物設計軟件Primer 5設計引物，其中上游引物序列為SEQ ID NO: 12，下游引物序列為SEQ ID NO: 13，由上海生物工程技術服務有限公司合成。擴增包括插入目的基因的DNA片段。PCR擴增片段為156bp，反應采用50ML反應體系。體系的組成為=IOXPCR緩沖液5ML，2.5mM dNTP 4ML，上游引物(10pmol/ML) 1ML，下游引物(10pmol/ML) 1ML，步驟 5 中轉化后的菌液3ML，Taq DNA聚合酶(5U/ML) 0. 3ML，補加ddH20至50ML。按以下條件進行PCR反應-MV，5min ；94°C，30sec ；60°C，30sec ；72°C, 30sec，共 35 個循環；72°C, IOmin 延伸后結 束反應。分別取5ML PCR產物，2%瓊脂糖凝膠電泳，檢查目的基因的擴增效果，電泳結果見圖8。6.陽性克隆測序挑選陽性克隆菌液測序(由Invitrogen公司進行3730型測序儀進行測序分析)。利用生物分析軟件DNAMAN進行同源性分析。構建成功的三種慢病毒干擾質粒分別命名為 LV-siRNAl、LV-siRNA2 和 LV-siRNA3(LV_siRNA 是對于用 pshRNA-copGFPLentivector構建的干擾質粒的簡稱,里面插入了 RNA干擾的dsDNA的序列)。實施例3 RNA干擾有效靶點的篩選 I.三種慢病毒干擾質粒轉染真核細胞
將 pcDNA3. I-BMP15 分別和 LV-siRNAl、LV-siRNA2 和 LV_siRNA3 共轉染入 CHO 細胞進行表達。設pcDNA3. I-BMP15和LV-shRNA-GFP空質粒共轉染CHO細胞作為對照，目的為與處理組轉染背景一致,每個處理設6個重復。其中pcDNA3. I-BMP15與慢病毒干擾質粒的比例為1:1。脂質體轉染，按照Polyfect (購自QIAGEN公司)試劑說明書進行。(I)轉染前一天，在新六孔板培養皿中接種細胞，完全吹散細胞以保證細胞均勻的分布。當轉染時細胞最好鋪滿培養皿的40-90%。(2)將pcDNA3. I-BMP15和慢病毒干擾質粒按I: I共4ug，加RPMI-1640培養基補至IOOul,溫柔地上下顛倒混勻6-8次,室溫孵育5min ；
(3)取IOul的Polyfect加入到IOOul DNA/RPMI-1640培養基中溫柔地上下顛倒混勻6-8次,室溫孵育lOmin。(4)在第3步孵育形成轉染混合物的同時，用不含血清和抗生素的RPMI-1640洗細胞一次，然后加入I. 5mL含10%血清和1%抗生素的RPMI-1640完全培養基。(5)將第3步中產生的DNA/ RPMI-1640試劑混合物逐滴加入第4步中處理的六孔板培養皿中，輕輕地將混合物和培養基混勻，C02培養箱中37°C培養48小時，熒光倒置顯微鏡觀察轉染效率，部分細胞用Trizol收集，_70°C保存，用于RNA提取。2.轉染細胞總RNA提取
采用Invitrogen公司TRIzol Reagent提取轉染細胞總RNA。所用器材均經0. 1%DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌后在鼓風干烤箱中烤干，操作過程均在超凈臺中進行。為了防止質粒DNA 的污染，提取的 RNA 用無 RNase 的 DNA 酶消化(IOXbuffer 2 u L，DNA 酶 0. IuL, 17. 9u LRNA,反應總體系20 u L, 370C，Ih)。然后加入酚一氯仿抽提，去除DNA酶，異丙醇沉淀，最后用0. P/oDEPC水溶解。I %瓊脂糖凝膠電泳，結果拍照(見圖9 )。3. Real time-PCR檢測細胞內BMP15的表達豐度
BMP15的引物如下，BMP15上游引物SEQ ID NO: 14，下游引物SEQ ID NO: 15, PCR擴增片段為235bp。同體系設倉鼠P-actin基因為內參(P-actin上游引物SEQ ID NO: 16，下游引物SEQ ID NO: 17)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，擴增片段為428bp。以提取的總RNA為模板，以Oligo-dT為引物(工作濃度為lOpmol/y L)進行RT反應。取總RNA IOii L，65°C水浴lOmin，加Oligo-dT引物Iy L，70°C預變性5min，立即冰浴 5min ;在冰浴狀態下加入 5 X AMV 緩沖液 6 u L, Rnasin 0. 4 u L(40U, Promega)，dNTPI. 5u L, AMV 0. 2u L(8U, Promega)，用水補足至總體積 30y L，混勻后于 42°C反應 lh，80°C滅活5min。所有反轉錄產物用IXTE稀釋4倍，_20°C保存備用。 以RT反應產物為模板，進行PCR反應(BMP15擴增片段235bp ； ^ -actin擴增片段 428bp)，體系的組成為10XPCI^^4^5ML，2.5mM dNTP 4ML，上、下游引物(10pmol/ML)各1ML，模板2ML，Taq DNA聚合酶(5U/ML)0. 3ML，補加ddH20至50ML。反應條件95°C預變性 5min;95°C 30sec,58°C 30sec，72°C，30sec，35 個循環；72°C延伸 lOmin。。在熒光定量PCR專用96孔PCR板(置于冰上)(ABI公司，美國)的每個孔里分別加入2W模板(樣本的RT產物或系列標準品)，然后加入23W預混溶液(包括12. 5WRealtime PCR Master Mix、0. 8 WlO剛引物、9. 7W滅菌雙蒸水)，總反應體系為25耵。用小心將熒光定量PCR專用的96孔PCR板封口膜(ABgene公司，英國)覆蓋在PCR板上，壓緊，保證每個孔不透氣，短暫離心。每個處理設3個重復，并在每塊板上同時設陰性對照(以水為模板)。按ABI7500型熒光定量PCR儀的操作說明放入96孔PCR板，設置PCR反應條件為95°C，Imin ；95°C,15s，58°C，10sec，72°C，40sec，循環40圈。在確認目的基因與內參照P-actin基因實時熒光定量PCR擴增效率基本接近時(差異小于5% )，目的基因BMP15的擴增效率為88. 5%，內
(I. Eufrx
參f3 -actin的擴增效率為91. 3%。目的基因mRNA表達豐度可以用Aj/ Bm=-.......................................................:丨丨圖丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨
(l+&frr
計算得到。轉染CHO細胞系熒光圖見圖10。結果發現，與共轉染pcDNA3. I-BMP 15 質粒和 pshRNA-copGFP Lentivector 空質粒48h后相比，細胞共轉染pcDNA3. I-BMP15和慢病毒干擾質粒LV- siRNA以后，BMP15mRNA表達極顯著下降(見圖11)。結果顯示三個慢病毒干擾質粒都一定程度抑制了 BMP15的表達，數據分析表明LV- siRNAl抑制效率為57. 75%，LV- siRNA2抑制效率為29. 25%，LV-siRNA3抑制效率為82. 5% (見圖11)。轉染慢病毒質粒后的CHO細胞裂解液中BMP15蛋白濃度明顯下降(見圖12)。綜上所述，體外細胞實驗表明本發明涉及的BMP15 shRNA干擾質粒可有效地干預BMP15基因的表達，可用于制造下調水牛骨形態發生蛋白15基因表達的制劑，提高水牛繁殖率。
權利要求
1.一種抑制水牛骨形態發生蛋白15基因表達的SiRNA，其特征在于，所述SiRNA的正義鏈具有以下任一序列BMP15-1 SEQ ID NO:I ；BMPI5-2 SEQ ID NO:2 ；BMPI5-3 SEQ ID NO:3。
2.—種shRNA，其特征在于含有權利要求I所述的siRNA。
3.如權利要求2所述的shRNA，其特征在于，是以下任一雙鏈核苷酸序列 BMP15-ldsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列； BMP15-2dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列； BMP15-3dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDN0:9所示的核苷酸序列。
4.一種表達載體，其特征在于，是由權利要求3所述的shRNA編碼基因與出發載體構建。
5.如權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述出發載體為慢病毒載體pshRNA-copGFP Lentivector0
6.如權利要求I所述的siRNA在制備抑制水牛骨形態發生蛋白15表達的藥物中的應用。
7.如權利要求I所述的siRNA在提高水牛繁殖率上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抑制水牛骨形態發生蛋白15(bonemorphogeneticprotein15，BMP15)基因表達的siRNA，屬于基因工程技術領域。本發明所述的siRNA正義鏈具有SEQIDNO:1~3所示的任一序列。本發明還公開了含有該siRNA的shRNA編碼基因及由其構建的慢病毒干擾質粒pshRNA-copGFPLentivector。通過實時定量Real-timePCR檢測發現，各siRNA片段分別能使水牛BMP15mRNA表達量降低29.25%，57.75%，82.5%；ELISA檢測BMP15蛋白表達量也相應降低。本發明的siRNA片段及其表達載體可用于制備抑制水牛BMP15表達的制劑，能夠顯著下調BMP15基因的表達量。
文檔編號C12N15/63GK102965371SQ20121043778
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者習欠云, 張永亮, 施振旦, 肖敏, 焦莉, 石德順, 劉慶友 申請人:華南農業大學