專利名稱：一種斷端對接式發夾型dna探針構建方法
技術領域：
本發明涉及生物分子診斷和生物芯片技術領域，具體涉及一種斷端對接式發夾型DNA探針的構建方法。
背景技術：
發夾型DNA探針(原始結構又叫分子信標molecular beacon)是根據核酸堿基配對原則和突光共振能量轉移(fluores-cence resonance energy transfer, FRET)現象設計、常溫下空間結構上呈莖環結構的一種DNA分子探針。環序列與靶核酸互補；莖由與靶序列無關的互補序列結合構成；兩末端分別標記熒光/淬滅分子。熒光FRET現象:常溫下發夾探針呈完整莖環結構時(折疊發夾狀態)，熒光/淬滅分子接觸緊密，因淬滅作用熒光信號很弱(抑光態)；當溫度升高或環序列與靶序列結合后，莖環打開(展開狀態)，熒光/淬滅分子對分離，淬滅作用減弱，熒光信號較強(發光態)；溫度下降可復原，呈現隨溫度變化引起的可逆循環:“展開發光態-折疊抑光態”。發夾探針這種折展狀態導致“熒光釋放-抑制”與溫度和靶序列等高度相關。與常規線型核酸探針相比，隨結構變化而引起熒光信號顯著改變的發夾探針具有明顯優勢:1.非常的高特異性和靈敏度:發夾探針對單個堿基錯配、缺失或插入突變具有更強的檢測能力，特別適用于SNP位點(單核苷酸多態性)一類的單堿基改變檢測；2.性能穩定可重復使用等。目前常作為游離態探針應用于熒光定量PCR、活體內核酸檢測等無固載技術領域。生物固載技術指生物分子(如探針等)固定在芯片、磁珠、微球等載體表面作識別探針的技術，核心是探針分子。發夾探 針素有“光開關”之稱，折-展狀態與靶環單堿基匹配程度高度關聯，設計嚴密的發夾靶環錯一個堿基也不能打開莖環，因此特別適用于單鹼基位點檢測。但長久以來受結構限制(探針兩末端分別修飾熒光-淬滅分子對而占用，缺少一個連接臂固定在載體表面)，常為游離狀態的發夾探針在芯片在固載表面的固定難題一直制約著其在生物固載領域的運用，并嚴重影響其優越性能發揮。為解決固定難題，按常規思路需要加一條連接臂與載體連接，環不能動，國內外學者只能在探針的莖臂上修飾，這也是目前的主研方向。莖臂修飾的發夾探針(國內外報道最多見)是莖臂修飾生物素方式:生物素(biotin)修飾到探針莖臂，親和素(avidin)固定到芯片表面,通過biotin-avidin結合力固定，問題:1，發夾探針莖臂修飾有很高技術難度。2，莖臂修飾生物素的游離態發夾探針與芯片表面親和素結合無特異性:難以應用檢測多分子，國外有少量研究報道目前主要限于單分子檢測。另一種中間修飾方式:莖臂單側延長末端修飾固定、與互補鏈熒光素對應中間位置修飾淬滅分子以達到熒光淬滅效應。但仍然存在兩個問題:1，發夾探針的莖臂中間修飾淬滅素分子仍然存在較高技術難度和較高的修飾合成成本；2，中間標記對熒光分子(或淬滅分子)本身具有高選擇性，許多性能優良的常用熒光分子由于技術原因無法中間修飾，從而影響到使用。以上“莖臂修飾”(即中間修飾)都存在較高技術難度和修飾昂貴等痼疾；第二種還存在只能標記高選擇性熒光/淬滅分子問題。核心問題是解決發夾探針在固載表面的固定難題。我們對問題進行了深入剖析:熒光-淬滅分子對的距離遠近引起的熒光共振能量轉移(FRET)現象是發夾探針諸多優勢的原始技術來源，因此設計原則上離不開熒光/淬滅這兩個分子對，而要固定到固載支持物表面就必須還要接一個連接分子(如生物素/氨基/巰基等)。發夾探針展開后是一條完整的單鏈核酸(一般30-40bp)，只有兩個末端(3'、5'端)；而熒光分子、淬滅分子、連接分子，這三個必須分開的大分子按照常規思路設計是無論如何也不能同時放到兩端的，如果兩末端分別修飾熒光/淬滅分子而占用，必然有第三個分子被“擠”在被占用的探針兩末端以外，這就是造成國內外在該領域研究中必須要涉及核酸單鏈中間修飾的根本原因。這也是長期以來弓丨起發夾探針固定難題及其運用的根本原因。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是:避開“單鏈核酸中間修飾”這個常規思路設計而提出一種DNA探針構建方法，依照該方法構建的DNA探針能保證無靶序列存在時熒光一淬滅分子對緊鄰(無熒光)、有靶序列存在并雜交后分離(發出熒光)，即保證熒光FRET現象前題下，把“熒光分子、淬滅分子、連接分子”三者放到發夾探針上，更充分發揮發夾型DNA探針的優勢。為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案:
一種斷端對接式發夾型DNA探針構建方法，包括以下步驟:
(I )構建斷端對接式發夾型DNA探針的主鏈，包括依次相連的第一莖序列、環序列、第二莖序列、延長臂序列，其中環序列是與靶序列完全匹配的堿基序列，兩莖序列堿基互補且互補結合；
第一莖序列的一端與環序列相連，另一端修飾熒光分子或淬滅分子，延長臂序列的一端與第二莖序列相連，另一端修飾用于與生物載體表面相固定的固定基團；
(2)構建斷端對接式發夾型DNA探針的輔鏈，是與所述延長臂序列完全堿基互補的單鏈核酸；將輔鏈的預設相近末端修飾與步驟(I)中的熒光分子或淬滅分子相對應的淬滅分子或熒光分子；(所述預設相近末端，即根據堿基配對原則，主、輔鏈互補結合后輔鏈兩末端中將與第一莖序列相近的一端。)
(3)將上述主、輔鏈互補結合,最后用軟件驗證生成物的發夾結構，并經genbank比對，驗證合格后即完成斷端對接式發夾型DNA探針。應用本發明的構建方法，所形成產物結構如下:斷端對接式發夾型DNA探針，包括主鏈與輔鏈；其中主鏈包括依次相連的第一莖序列、環序列、第二莖序列、延長臂序列，其中環序列是與靶序列完全匹配的堿基序列，第一、二莖序列堿基互補且互補結合；第一莖序列的一端與環序列相連，另一端修飾有熒光分子或淬滅分子，延長臂序列的一端與第二莖序列相連，另一端修飾有用于與生物載體表面相固定的固定基團；
輔鏈是與所述延長臂序列堿基互補且互補結合的單鏈核酸，在輔鏈上、與第一莖序列相近的末端修飾有與上述熒光分子或淬滅分子相對應的淬滅分子或熒光分子，主、輔鏈結合形成突光一淬滅分子對。
進一步，所述生物載體包括生物分子固定化基片、殼聚糖。進一步，所述固定基團包括氨基基團。 上述斷端對接式發夾型DNA探針，探針分為由主鏈和輔鏈兩段，主鏈呈帶延長臂的發夾結構，延長臂末端修飾氨基等常規固定基團以方便固定在芯片、磁珠、殼聚糖等生物載體表面，以常規成熟方式完成固定過程，第一莖序列末端按常規方式修飾熒光分子；輔鏈呈一短片段的單鏈核酸，根據堿基配對輔鏈上預設與第一莖序列相近的末端按常規方式修飾與主鏈修飾的熒光分子或淬滅分子相對應的淬滅分子或熒光分子。輔鏈序列與主鏈的延長臂序列堿基互補，主、輔鏈互補結合后，輔鏈末端的淬滅分子或熒光分子與主鏈末端的熒光分子或淬滅分子正好斷端對接緊密靠近，形成具有熒光FRET現象的熒光一淬滅分子對。應用本發明構建方法所形成的斷接式發夾探針，在其使用時，主鏈延長臂末端修飾氨基等常規固定基團固定在芯片、磁珠等生物載體表面，輔鏈與主鏈延長臂互補形成雙鏈，輔鏈末端的淬滅分子或熒光分子與主鏈莖序列末端的熒光分子或淬滅分子正好斷端對接緊密靠近，形成熒光一淬滅分子對的完整結構而具有顯著的淬滅作用。當有靶序列存在時，與互補的主鏈環序列雜交結合拉開主鏈的莖結構，從而使斷端對接的熒光一淬滅分子對分開，發生熒光FRET現象:淬滅作用消失，在激發光照射下發出熒光，從而檢測到靶序列的存在；沒有靶序列時，則探針結構完整檢測不到熒光。應用本發明構建方法所形成的發夾型DNA探針相比于現有的發夾型DNA探針技術，具有以下有益效果及優點:
(I)合成技術難度低，易于實現。無論是主鏈兩末端修飾熒光分子和固定基團(即所述的連接分子)，還是輔助鏈末端修飾淬滅分子，都是成熟的末端標記(修飾)常規技術，沒有任何一點困難也沒有合成成本提高的問題，通過巧妙設計的互補雙鏈核酸斷端對接，使熒光素和淬滅素緊密接觸， 使傳統發夾型DNA探針的技術核心——熒光共振能量轉移(FRET)現象得以變位實現。當靶分子與探針雜交結合后莖環結構打開，熒光分子遠離淬滅分子而發出突光。(2)避開了傳統設計最主要的技術難點:發夾探針莖臂中間修飾技術難。(3)該探針在設計使用上具有較好的適用性。如在針對高通量多分子檢測時要設計相應的高通量探針群，設計者只需專注設計主鏈環序列的雜交特異性，其余如主鏈莖結構及單側延長臂序列、輔助鏈序列均只使用一種設計，并可通用于所有的高通量探針群，減化了設計難度。
下面結合附圖和實施例對本發明技術方案進一步說明:
圖1本發明方法構建的斷端對接式發夾型DNA探針結構示意圖。圖2本發明方法構建的斷端對接式發夾型DNA探針使用性能示意圖。圖3本發明方法構建的斷接式發夾型DNA探針實際檢測結核基因片段結果
具體實施例方式 實施例1本發明方法所構建的探針
圖1、圖2是本發明方法構建的斷端對接式發夾型DNA探針結構和使用性能示意圖，是針對如該圖2中所示的靶序列所構建，由圖2可見，主鏈(A鏈)延長臂末端修飾氨基等常規固定基團固定在芯片、殼聚糖、磁珠等生物載體表面，輔鏈(B鏈)與主鏈(A鏈)延長臂下段互補形成雙鏈，輔鏈(B鏈)末端的淬滅分子與主鏈(A鏈)莖序列末端的熒光分子正好斷端對接緊密靠近，形成熒光-淬滅分子對的完整結構而具有顯著的淬滅作用。當有靶序列存在時，與互補的主鏈(A鏈)環序列雜交結合拉開主鏈(A鏈)的莖結構，從而使斷端對接的熒光-淬滅分子對分開，發生熒光FRET現象:淬滅作用消失，在激發光照射下發出熒光，從而檢測到靶序列的存在；沒有靶序列時，則探針結構完整檢測不到熒光。實施例2靈敏性試驗
以不同濃度祀序列做靈敏性試驗，先觀察第一組:10mg/L、5mg/L、lmg/L ;第二組:500ug/L、100ug/L、10ug/L、lug/L ；、第三組:500pg/L、100pg/L、10pg/L、lpg/L 等不同濃度組別靶序列與預先設計好的斷接式發夾探針雜交后，在芯片掃描儀上觀測熒光強度，確定檢測的最低濃度組別單位(mg\ug\pg)，再往下作某一濃度組別單位的精確濃度靈敏性試驗，如 pg 級:500pg/L、400pg/L、300pg/L、100pg/L、50pg/L、40pg/L、30pg/L、20pg/L、IOpg/L...試驗結果:
在芯片掃描儀上觀測熒光強度:最低濃度與陰性對照熒光具有明顯區別。(一般以陽性熒光/陰性熒光> 1.5為判斷標準)說明本發明的方法構建的探針具有高靈敏性。實施例3特異性試驗
預先設計好靶序列及對應斷接式發夾探針，另外設計合成10條與預先設計好的靶序列及斷接式發夾探針無關的干擾序列(經比對證明不能雜交結合)，在雜交條件固定情況下分別與特異性斷接式發夾探針雜交，在芯片掃描儀上觀測熒光，比較特異性靶序列和無關干擾序列與特異探針雜交的熒光信號強弱。試驗結果:特異性靶序列與特異性斷接式發夾探針雜交熒光信號強，而無關干擾序列與特異探針無雜交熒光背境信號弱。說明斷接式發夾探針能特異性檢測特異靶序 列。實施例4本發明的探針能進行大規模檢測的試驗
預先設計好針對某病原體(如結核分支桿菌TB)特異片段的靶序列及對應斷接式發夾探針，收集臨床相應某病原菌標本(如TB)若干(> 400份)，標本處理后分別與對應探針雜交，觀察雜交的熒光信號，設陰性對照，從而證明該探針能大規模進行臨床檢測。芯片表面高密度點樣，一份樣本雙份點樣，統一設陰性對照，雜交沖洗后，突光掃描儀下掃描，以陽性熒光/陰性熒光> 1.5為判斷標準(以儀器軟件分析)。實施例5本發明的斷接式發夾探針設計方法及其在對結核桿菌基因檢測上的應用
步驟一:針對結核桿菌保守序列IS986通過軟件Primer 5.0設計祀序列 (O下表中間為擴增目標產物為245bp (加粗)，兩端為擴增引物(字下加線表示) Primerl: 5’ -CGTGAGGGATCGAGGTGGC-3，
Primer2: 5’ -GCGTAGGCTCGGTGACAAA-3’
ccgcgagggc cccgatggtt tgcggtgggg tgtcgagtcg atctgcacac agctgaccgagctgggtgtg ccgatcgccc catcgaccta ctacgaccac atcaaccggg agcccagccgccgcgagctg cgcgatggcg aactcaagga gcacatcagc cgcgtccacg ccgccaactacggtgtttac ggtgcccgca aagtgtggct aaccctgaac cgtgagggca tcgaggtggccagatgcacc gtcgaacggc tgatgaccaa actcggcctg tccgggacca cccgcggcaaagcccgcagg accacgatcg ctgatccggc cacagcccgt cccgccgatc tcgtccagcgccgcttcgga ccaccagcac ctaaccggct gtgggtagca gacctcacct atgtgtcgacctgggcaggg ttcgcctacg tggcctttgt caccgacgcc tacgctcgga ggatcctgggctggcgggtc gcttccacga tggccacctc catggtcctc gacgcgatcg agcaagccatctggacccgc caacaagaag gcgtactcga cctgaaagac gttatccacc atacggatag
(2)針對中間245bp擴增產物通過軟件(Beacon Designer)設計祀序列:
上表774-797中斜體文字表示: 5’ —tccagcg ccgcttcgga ccaccagS，
步驟二:設計主鏈(A鏈)環堿基序列:即以上靶序列的對應互補序列:
5， -CTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGA-3’
步驟三:設計主鏈(A鏈)兩個互補的短鏈堿基序列構成莖結構:
5， - GAGCTC-3，
步驟四:設計主鏈(A鏈)延長臂堿基序列 5’ - GTTTTTTTTTTTTTTC-3’
步驟五:設計輔鏈(B鏈)堿基序列 5， - CAAAAAAAAAAAAAAG-3，
步驟六:按以下方案設計:
修飾FAM到主鏈(A鏈)一側莖結構3’:
5，- GAGCTC-3，-FAM ；
修飾氨基到主鏈(A鏈)長鏈延長臂下段堿基序列5’端:
氨基一5，- GTTTTTTTTTTTTTTC-3，
修飾DABCYL到輔鏈(B鏈)堿基序列5’端:
DABCYL—5， -GAAAAAAAAAAAAAAC-3，
步驟七:按上述設計在DNA合成儀上(如ABI394高通量DNA合成儀)合成針對結核桿菌保守序列IS986的主鏈(A鏈)和輔鏈(B鏈)構成的斷接式發夾探針，并經genebank和DNAstar軟件證實并保證特異性。結核桿囷保守序列IS986斷接式發夾探針:
主鏈(A鏈):
氨基-5，-GTTTTTTTTTTTTTTCGAGCTCCTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGAGAGCTC-3，-FAM 輔鏈(B 鏈):DABCYL— 5’ -GAAAAAAAAAAAAAAC-3’
步驟八:然后按芯片實驗的常規方法進行固定、擴增、純化、雜交、芯片沖洗掃描和進行熒光信號數據分析。分析結果見圖3，由圖3可見陽性熒光信號較之陰性信號區別非常明顯，說明該發明的斷接式發夾探針效果非常明顯，完全能夠投入芯片等固載領域實際應用。對于本領域的技術人員來說，在不脫離本發明結構的前提下，還可以作出若干變形和改進，如主鏈莖序列末端可修飾熒光分子，還可修飾淬滅分子(視選定的第一莖序列是位于5’還是3’而定)，輔鏈末端則是修飾對應的淬滅分子或熒光分子；對于淬滅分子、熒光分子、固定基團(連接分子)類型的具體選擇，本發明不作具體限定，凡本領域技術人員所知淬滅分子、熒光分子，在不影響本發明技術效果的前提下，均可應用；這些也應該視為本發明的保護范圍，這些都不會影響本 發明實施的效果和專利的實用性。
權利要求
1.一種斷端對接式發夾型DNA探針構建方法，其特征在于，包括以下步驟: (I )構建斷端對接式發夾型DNA探針的主鏈，包括依次相連的第一莖序列、環序列、第二莖序列、延長臂序列，其中環序列是與靶序列完全匹配的堿基序列，兩莖序列堿基互補且互補結合； 第一莖序列的一端與環序列相連，另一端修飾熒光分子或淬滅分子，延長臂序列的一端與第二莖序列相連，另一端修飾用于與生物載體表面相固定的固定基團； (2)構建斷端對接式發夾型DNA探針的輔鏈，是與所述延長臂序列完全堿基互補的單鏈核酸；將輔鏈的預設相近末端修飾與步驟(I)中的熒光分子或淬滅分子相對應的淬滅分子或突光分子； (3)將上述主、輔鏈互補結合,最后用軟件驗證生成物的發夾結構，并經genbank比對，驗證合格后即完成斷端對接式發夾型DN`A探針。
全文摘要
本發明公開了一種斷端對接式發夾型DNA探針的構建方法，包括(1)構建斷端對接式發夾型DNA探針的主鏈，其中主鏈包括依次相連的第一莖序列、環序列、第二莖序列、延長臂序列，其中環序列是與靶序列完全匹配的堿基序列，兩莖序列互補結合；(2)構建輔鏈，輔鏈是與所述延長臂序列互補結合的單鏈核酸；在輔鏈上、與第一莖序列相近的末端修飾有與上述熒光分子或淬滅分子相對應的淬滅分子或熒光分子，(3)結合主、輔鏈形成熒光－淬滅分子對。本發明克服了中間修飾存在的高技術難度和修飾昂貴的技術缺陷，通過互補雙鏈核酸斷端對接，使熒光素和淬滅素緊鄰，使熒光共振能量轉移(FRET)現象得以變位實現。
文檔編號C12N15/11GK103243154SQ20121043150
公開日2013年8月14日 申請日期2011年2月28日 優先權日2011年2月28日
發明者陳慶海 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院