專利名稱：郁金香查爾酮異構酶TfCHI蛋白及其編碼基因和探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及郁金香花色苷合成途徑中的關鍵酶及其編碼基因和探針，具體涉及一種郁金香查爾酮異構酶TfCHI蛋白及其編碼基因和探針。
背景技術：
花朵的顏色是決定其商品價值和觀賞價值的重要因素之一。花朵的顏色是花色素積累的結果，花色素主要包括類黃酮、類胡蘿卜素以及甜菜堿類。類黃酮作為三大花色素之一，使花產生從黃到紫的全部顏色。類黃酮生物合成途徑是目前研究的較清楚的代謝途徑之一，其中花色苷的生物合成途徑是被研究的最廣泛和深入的。查爾酮異構酶(Chalcone isomerase CHI)是花色苷生物合成途徑中緊接查爾酮合成酶(CHS)的第二個酶，它將黃色的查爾酮催化轉化為無色的黃烷酮。植物體內幾乎所有的類黃酮類化合物都是由黃烷酮衍生而來，因此該酶對類黃酮類化合物合成有重要作用。當CHI活性受抑制時花朵會變為黃色。如通過插入轉座子的方法突變康乃馨花瓣中的CHI基因，會使白色的花朵變成黃色；當矮牽牛花藥中CHI基因的啟動子失活時產生了黃色或淺綠色的花粉等。這些結果表明，調控CHI基因的表達水平會影響花朵的顏色。
CHI的編碼基因是一個多基因家族，該基因已從多種植物中分離出來，如矮牽牛、 菜豆、玉米等,但對于球根花丼郁金香(Tulipa fosteriana), CHI基因的克隆、表達模式及 CHI蛋白序列目前尚不清楚。目前，未有任何與郁金香CHI蛋白及其編碼基因序列相關的文獻報道。發明內容
本發明的目的在于填補郁金香CHI基因家族成員的克隆、表達模式分析以及郁金香CHI蛋白的空白，提供了一種郁金香CHI蛋白TfCHI，本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列以及檢測所述核酸序列的探針；本發明公開了郁金香TfCHI蛋白及其核酸序列在郁金香不同器官、不同發育階段的表達模式，為今后利用基因工程技術對TfCHI基因表達的時空特性進行調控，從而改變花色、創造新花色提供了理論依據，具有很大的應用價值。
一方面，本發明提供了具有郁金香查爾酮異構酶活性的蛋白質，所述蛋白質是由如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或由SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香查爾酮異構酶活性的蛋白質。該蛋白質在花朵的不同發育階段、不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。
優選的，所述蛋白質為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列經過I 50個氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個以內氨基酸而得到的序列。
進一步優選的，所述蛋白質為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列中I 10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
另一方面，本發明提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。
優選的，所述核酸序列具體為(a)堿基序列如SEQ ID NO. 3第I 693位所示； 或(b)與SEQ ID NO. 3第I 693位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(。)能與 SEQ ID NO. 3第I 693位所示的核酸進行雜交的序列。
優選的，所述核酸序列具體為SEQ ID NO. 3第I 693位所示的核酸序列中I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內核苷酸形成的序列。
此外，本發明還提供了一種檢測上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述核酸序列8 100個連續核苷酸的核酸分子，該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼郁金香 TfCHI相關的核酸分子。
在本發明中，“分離的DNA”、“純化的DNA”是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開， 而且已經與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。
在本發明中，術語“郁金香查爾酮異構酶TfCHI蛋白編碼序列”指編碼具有郁金香 TfCHI蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示的第I 693位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 3所示的第I 693位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性， 所以與SEQ ID NO. 3所示的第I 693位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 4所示的序列。該術語還包括與SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼天然郁金香TfCHI蛋白的相同功能、SEQ ID NO. 3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)通常為I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個以內核苷酸。
在本發明中，術語“郁金香查爾酮異構酶TfCHI蛋白”指具有郁金香TfCHI蛋白活性的SEQ ID NO. 4所示序列的多肽。該術語還包括具有與天然郁金香TfCHI蛋白相同功能的、SEQ ID NO. 4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)通常為I 50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內氨基酸。 例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。 又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括郁金香TfCHI蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發明的郁金香TfCHI蛋白的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與郁金香TfCHI相關DNA雜交的DNA 所編碼的蛋白、以及利用郁金香TfCHI蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發明中，“郁金香TfCHI保守性變異多肽”指與SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列相比，有至多10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行替換而產生。
表權利要求
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質 (a)由如SEQID NO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)SEQID NO. 4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加ー個或幾個氨基酸且具有郁金香查爾酮異構酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.如權利要求I所述的蛋白質，其特征是，所述蛋白質為SEQID NO. 4所示氨基酸序列經過I 50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個以內氨基酸而得到的序列。
3.如權利要求2所述的蛋白質，其特征是，所述蛋白質為SEQID NO. 4所示氨基酸序列中I 10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
4.ー種編碼權利要求I所述蛋白質的核酸序列。
5.如權利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為 Ca)喊基序列如SEQ ID NO. 3第I 693位所不； 或(b)與SEQ ID NO. 3第I 693位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID NO. 3第I 693位所示的核酸進行雜交的序列。
6.如權利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為SEQID NO. 3第I 693位所示的核酸序列中I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5 ^和/或:V端添加60個以內核苷酸形成的序列。
7.ー種用于檢測如權利要求4所述核酸序列的探針，其特征在于，所述探針為包含有所述核酸序列8 100個連續核苷酸的核酸分子。
全文摘要
本發明涉及一種郁金香查爾酮異構酶TfCHI蛋白及其編碼基因和探針，所述蛋白質為如下(a)或(b)的蛋白質(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香查爾酮異構酶活性的由(a)衍生的蛋白質。本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列，以及檢測上述核酸序列的探針；本發明為利用基因工程技術調控郁金香查爾酮異構酶TfCHI基因的時空表達特性，從而改變花色，創造新花色提供了理論依據，具有很大的應用價值。
文檔編號C12N15/61GK102978194SQ20121042846
公開日2013年3月20日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅 申請人:上海交通大學