一種膠原蛋白的制備方法
【專利摘要】本發明屬于生物活性物質提取領域，采用魚鱗為原料，胃蛋白酶酶解后得到膠原蛋白粗品，通過HPLC優化條件得到合適的流動相和柱分離條件，進一步放大到工業制備級液相色譜分離系統，精制得到高純度的膠原蛋白。本發明的優點是，粗品使用工業制備級液相色譜分離制備所需物質，可達到較好的分離提純效果，所需溶劑成本低，操作簡單，周期短，效率高，純度可達99.5%以上。
【專利說明】一種膠原蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體涉及一種高純度膠原蛋白的工業方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是結締組織中極其重要的一種結構蛋白，現已廣泛應用于食品、化妝品、營養保健品、生物肥料以及醫用材料等領域。它廣泛存在于動物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中。魚鱗含有豐富的蛋白質和鈣、磷等礦物質，主要由蛋白質和羥基磷灰石組成，其中蛋白質占魚鱗總重的50%~70%，主要為膠原蛋白和角蛋白，可見魚鱗是非常好的膠原蛋白生產原料。目前國外對從海洋魚類魚鱗中提取膠原蛋白的工藝已較成熟，其膠原蛋白的提取率達到了 25%~55%，并已運用于工業化生產。而國內有關魚鱗中提取膠原蛋白的研究還處于起始階段，劉慶慧等對魚鱗中提取膠原蛋白進行了初步的研究。而對淡水魚魚鱗膠原蛋白的研究，僅有Kimura，S.對鯉魚魚鱗的提取及肽鏈組成進行了研究報道，且仍為采用傳統的乙酸作提取劑，提取率不高。尚未實現工業化生產。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于針對目前在制備膠原蛋白過程中所存在的工藝復雜以及純度不高的問題，提供一種制備高純度膠原蛋白的新方法。
[0004]為實現上述目的，本發明采取的技術方案為:
一種膠原蛋白的制備方法，采用魚鱗為原料，制備型高效液相色譜法制備高純度膠原蛋白，它包括以下步驟:
(1)將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用胃蛋白酶酶解24h，調至中性，凍干，得膠原蛋白粗·品;
(2)用甲醇溶解膠原蛋白粗品，采用HPLC優化膠原蛋白的最佳分離洗脫條件，將其等比例放大，應用在填充十八烷基反相硅膠填料的動態軸向壓縮柱上進行分離，在線收集膠原蛋白對應譜帶的餾分；
(3)將步驟(2)中收集的對應譜帶洗脫液減壓干燥，即可得到色譜純為99.5%的膠原蛋白。
[0005]本發明的有益效果是選用動態軸向壓縮柱來制備膠原蛋白，過程簡單、易控制，工藝技術簡化，生產成本低，適用于大規模制備。高效液相色譜測定中，總雜質峰小于0.5%，單一雜質峰不超過0.3%。此產品完全符合歐洲藥典標準。
【具體實施方式】
[0006]實施例1
1.將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，調至中性，凍干，得膠原蛋白粗品；
2.將膠原蛋白粗品注入動態軸向壓縮柱制備色譜系統，動態軸向壓縮柱尺寸為Φ50X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量500mg，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相甲醇與水體積比范圍為30/70-85/15，洗脫60min后，流動相甲醇與水的體積比切換為95/5，洗脫至80min，使后端雜質沖洗出來，一個分離周期結束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在43飛Omin的餾分，經HPLC分析純度≥ 99.6%。
[0007]實施例2
1.將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，調至中性，凍干，得膠原蛋白粗品；
2.將膠原蛋白粗品注入動態軸向壓縮柱制備色譜系統，動態軸向壓縮柱尺寸為Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量lg，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相甲醇與水體積比范圍為30/70-85/15，洗脫60min后，流動相甲醇與水的體積比切換為95/5，洗脫至80min，使后端雜質沖洗出來，一個分離周期結束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在41.5^52min的餾分，經HPLC分析純度≥ 99.5%。
[0008]實施例3
1.將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，調至中性，凍干，得膠原蛋白粗品；
2.將膠原蛋白粗品注入動態軸向壓縮柱制備色譜系統，動態軸向壓縮柱尺寸為Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量2g，流動相流速為100ml/min。分離初期，流動相甲醇與水體積比范圍為40/60-90/10，洗脫60min后，流動相甲醇與水的體積比切換為95/5，洗脫至80min，使后端雜質沖洗出來，一個分離周期結束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在4(T58min的餾分，經HPLC分析純度≥ 99.5%。
【權利要求】
1.一種膠原蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用胃蛋白酶酶解24h，調至中性，凍干，得膠原蛋白粗品; (2)將過濾后的膠原蛋白粗品通過進樣泵或者進樣閥注入動態軸向壓縮制備色譜系統； (3)采用甲醇和水做流動相，梯度洗脫，將色譜峰對應的流出液進行減壓干燥，即可得到高純度的膠原蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(2)中，在制備色譜系統中，采用動態軸向壓縮柱，規格為Φ50Χ250πιπ~Φ150Χ250πιπι，且所填充固定相為十八烷基反相硅膠填料，粒徑為10 μ m~45 μ m。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(3)中，梯度洗脫時，流動相甲醇與水的體積比(V/V)范圍為3:7~ 9:1。
【文檔編號】C12P21/06GK103789380SQ201210426852
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月31日 優先權日:2012年10月31日
【發明者】居延娟, 張宇, 王冰冰 申請人:江蘇漢邦科技有限公司