專利名稱：一種用于早期檢測下頜前突的血清/血漿miRNA標志物及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于早期檢測下頜前突患者的血清/血漿miRNA標志物及其應用。
背景技術：
下頜前突導致的前牙反合是口腔正畸臨床的常見畸形。前牙反合，俗稱“地包天”，表現為正中咬合時上前牙位于下前牙內側，可影響牙齒和面型的美觀、降低咀嚼效率，甚至導致顳下頜關節病并影響心理健康。由于復雜的顱頜面結構及不可預測的下頜生長方向，下頜前突所致的骨性反合治療難度很大，且治療后易復發，部分患者在治療5-8年后仍需要正畸和正頜手術聯合治療。骨性反合是逐漸發育形成的，下頜前突的早期檢測診斷有利 于治療方案的制定，也有利于療效的評估和復發機率的預測。下頜前突無論是對患者本身的生活還是心理都有較大的危害，但是目前的體檢方法無法準確地判斷前牙反合到底是由骨性的下頜前突還是單純的功能性錯合導致。因此，要有效地治療下頜前突，獲得更好的治療效果和預后情況，就需要獲得更為靈敏、特異、易于檢測的標志物。microRNA (miRNA)是一類非編碼的單鏈小分子RNA，廣泛存在于各生物物種中，目前發現有8000余種。它可與信使RNA(mRNA)上任意與之互補的序列相結合而抑制基因轉錄，或者使mRNA降解從而抑制基因表達。在各類小RNA中，miRNA具有最廣泛的調節功能，它能對基因活動(生長、分化、凋亡等)的各個層面進行調節，它在細胞中擔當“剎車”的功能，保障基因表達的準確性，在疾病的發生發展中發揮重要作用。miRNA雖然只占人類基因總數的2%，卻調控著人類30%以上的基因的表達。它被Science雜志評為2002年度“十大科學突破”之首，超過物理學界的中微子等重大發現，Nature、Science等雜志曾連續四年強調其重要性；miRNA研究的突破性進展，被稱為可與HGP (人類基因組計劃)相提并論，是生物醫學領域近20年來重大成果之一。目前，圍繞miRNA的研究在國內外正如火如荼地進行著，我們不難推測miRNA將是未來幾年內研究的焦點之一。miRNA不僅具有高度的組織特異性，以往研究還表明血清/血漿在室溫24小時后再反復凍融8次，其中miRNA含量仍保持不變，它們的穩定性使得其實際值與在病人身上得到的測試值吻合得很好，從而在判斷血清/血漿異常表達miRNA的功能時有其可行性。尋找疾病的生物學標志一直是一個重要的研究領域。從患病部位(如腫瘤組織等)取組織測定蛋白或核酸表達，尋找該病的生物學標志，有利于了解該疾病的形成機制，以及早期診斷和治療、療效檢測等，但該操作創傷較大，不利于臨床廣泛開展。血清/血漿樣本采集方便、創傷性小，易于實施，IOul便足夠分析數十種miRNA的表達水平。近來研究表明血清/血漿miRNA標志物在骨骼和顱頜面發育過程中發揮著重要調控作用，并可用于多種疾病的前期診斷和治療指導，但還沒有關于血清/血漿miRNA用于檢測下頜前突方面的報道。
發明內容
解決的技術問題本發明的首要目的在于針對現有技術的上述不足，提供一種用于早期檢測下頜前突的血清/血漿miRNA標志物。本發明的另一目的是提供上述血清/血漿miRNA標志物在制備上頜前突早期診斷、預后檢測的試劑盒中的應用。本發明的又一目的是提供用于下頜前突早期檢測的試劑盒。申請人:通過分離和研究下頜前突及年齡匹配的正常對照血清/血漿中的miRNAs，尋找與下頜前突高度相關的高特異性和敏感性的miRNAs，為下頜前突的早期檢測、篩查和診斷提供數據支持，為下頜前突的預后及臨床治療效果的評價提供數據支持。技術方案 一種用于早期檢測下頜前突的血清/血漿miRNA標志物，該標志物為let_7i_3p或miR-595中的一種或者兩種組合物。上述用于早期檢測下頜前突的血清/血漿miRNA標志物在制備早期檢測下頜前突的試劑盒中的應用。一種下頜前突早期檢測診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測血清/血漿中let-7i_3p或miR-595中的一種或者兩種組合物。一種下頜前突早期診斷試劑盒，該試劑盒含有一種或者兩種血清/血漿miRNA標志物的引物let-7i_3p的引物(Taqman引物探針貨號002172)和miR-595的引物(Taqman引物探針貨號001987),可由Applied Biosystems公司(美國)購得。所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應常用試劑，如Taq酶，逆轉錄酶，緩沖液，dNTPs, MgCl2和DEPC水等；還可以含有標準品和/或對照品。本發明所述的血清/血漿miRNA標志物的篩選方法包括以下步驟(圖I)(I)建立統一標準的標本庫和數據庫以標準操作程序(SOP)從醫院采集的血液樣本，系統收集完整的人口學資料和臨床資料。(2)血清/血衆miRNA差異表達譜分析采用microarray生物芯片，對下頜前突患者和正常對照者的血清/血漿中已知的人全部成熟miRNAs進行檢測，篩選出差異表達的miRNAs :let-7i_3p (SEQ ID No. I),miR-595 (SEQ ID No.2),miR-16-2_3p (SEQ ID No. 3)和 miR-367-5p (SEQ ID No. 4)(表 I)。(3)用實時定量PCR方法(Taqman探針法)篩選可用作檢測標志物的血清/血漿miRNA:對下頜前突患者和正常對照者的血清/血漿進行miRNA的提取，逆轉錄，并進行大樣本實時定量分析驗證，確定能夠用于區分下頜前突患者和正常對照組的miRNAs let-7i-3p (SEQ ID No. I)和 miR-595 (SEQ ID No. 2)。(4)血清/血漿miRNA診斷試劑盒的研制根據實時定量PCR最終篩選出的差異表達的血清/血衆miRNAs,開發特異miRNAs( let-7i_3p、miR-595中的一種或者兩種)診斷試劑盒，實現臨床上對下頜前突的早期檢測和預后監測的目的。診斷試劑盒包括let-7i-3p、miR-595的Taqman引物探針,逆轉錄酶，Taq酶,緩沖液，dNTPs等試劑。本發明使用的檢測方法可以選自microarray生物芯片、miRNA提取、逆轉錄、實時定量PCR方法中的一種或幾種。
以下是本發明進一步的說明在microarray生物芯片測序結果,本發明人檢測到18例下頜前突和18例正常對照血清/血漿中存在差異表達且有統計學意義(P〈0. 05)的miRNAs包括miR-16-2_3p，miR-369_3p, miR-24-2_5p, miR_450a, miR-500a_3p，miR-595, miR-502_3p, miR-18a_3p,miR-367_5p, miR-3142, let_7i_3p。根據上述結果,選擇滿足下列條件的miRNAs并用實時定量PCR進一步驗證1)兩組的差異倍數達2倍及2倍以上(P〈0. 05)的miRNA作為本發明中初步篩選出的血清/血漿marker ;2)這些miRNAs在兩組研究對象中的芯片拷貝數都要大于50，以提高檢測效率。滿足上述條件的miRNAs 包括miR-16-2-3p，miR-595，miR-367-5p，let_7i_3p (圖2)。實時定量PCR結果發現在剩下的42例下頜前突和50例正常對照樣本中，有2種miRNAs在下頜前突組和正常對照組中的表達情況存在顯著性差異let-7i-3p在下頜前突病例中 高表達，miR-595在下頜前突病例中低表達。多因素logistic回歸分析及ROC曲線分析結果表明，這2種miRNAs的表達水平均與下頜前突存在著顯著關聯。let-7i-3p的曲線下面積(AUC)達到O. 896 (95%可信區間為
O.817-0. 976)，miR-595 的 AUC 達到 O. 923 (95% 可信區間為 O. 860-0. 986)(圖 3)。在截斷點設為O. 65時，let-7i-3p達到敏感度83. 3%，特異性92. 9% ；miR-595達到敏感度85. 7%,特異性95. 2%，顯示了 let-7i-3p和miR-595對下頜前突診斷具有較高的特異性和敏感性本說明書中血清/血漿是指血清和(或)血漿。有益效果I、血清/血漿miRNA標志物是一種新型生物標志物，與傳統生物標志物相比具有很多優勢1)血清/血漿采集方便、創傷性小，易于實施；2) miRNA在血清/血漿中表達穩定，測試值與在病人身上得到的實際值吻合；3)定量準確，對疾病診斷的敏感性和特異性很高；4)血清/血漿miRNA檢測能在分子水平上反映疾病發生過程的基因轉錄后調控狀態，通過TargetScan官方網站及基因功能分析軟件(Gene Ontology)可以為下頜前突發病機制的分子研究與治療提供潛在的靶基因與信號通路。因此，血清/血漿miRNA標志物的成功開發是對以蛋白為主的傳統生物標志物的顛覆，將為下頜前突提供分子治療的可能性，并為其它疾病的生物標志物研制提供借鑒。2、本發明所述的血清/血漿miRNA標志物研制出的檢測試劑或工具，為下頜前突的發生和進展機制的研究提供數據支持；通過血清/血漿miRNA標志物診斷試劑盒的研制和應用，使得下頜前突的早期檢測方便易行，為口腔正畸臨床醫生及早發現骨性下頜前突并采取有效恰當的治療方案提供有力的支持，從而有效地減少了治療時間并避免了不必要的往返治療，還能夠對病例進行治療動態評估及預后監測，從而有助于減少下頜前突的復發。
圖I是血清/血漿miRNA標志物的篩選及試劑盒的主要流程。圖2是初篩的血清/血漿miRNA標志物在實時定量PCR中的表達水平。圖3顯示多因素logistic回歸分析let-7i_3p、miR-595診斷下頜前突的ROC曲線。
具體實施例方式實施例I樣本的收集與整理發明人于2011年7月至2012年8月間從南京醫科大學附屬口腔醫院正畸科收集了 128例(60例下頜前突的血清樣本和68例正常對照的血清樣本)符合標準的樣本進行研究。研究樣本的選擇標準(I)臨床患者的側貌面型為凹面型；
(2) 口腔內及模型檢查為前牙反合；(3) X片測量為上頜正常，下頜前突；(4)與病例年齡匹配的生長期正常對照。microarray 芯片測序利用microarray生物芯片檢測收集的樣本中隨機選取的18例生長期下頜前突患者和18例正常對照的血清樣本。芯片檢測由康辰生物科技有限公司(上海，中國)完成。從芯片結果中篩選表達差異超過2倍(P〈0. 05)的miRNAs。miRNAs 的提取運用NucleoSpin試劑盒(MACHEREY-NAGEL公司，德國)對剩余的42例下頜前突樣本和50例正常對照樣本的血清進行miRNAs提取，具體步驟如下I)樣本準備血清樣本于_80°C儲存，4°C融化，搖晃均勻。取2mL RNase-free EP管，吸入300μL血清，加入2μLcel-miR-238 對照探針(SEQ ID No. 5)(表I)作為各個樣本之間的統一參照，加入90 μ L MPL裂解液。震蕩5s。室溫靜置3min。2)沉淀蛋白質加入30 μ LMPP蛋白沉淀緩沖液，震蕩5s，室溫靜置lmin。11，000g/min轉速(下同)離心30s,沉淀蛋白質。3)調整DNA及RNA結合環境將上清液轉移至2mL收集管(帶蓋)，加入400 μ L異丙醇以調整DNA及RNA結合環境，震蕩5s。4)結合 DNA 及 RNA將樣本加在分離柱套管上，室溫靜置2min，離心30s。5)洗滌、干燥加入100 μ L麗I沖洗緩沖液，離心30s，棄去過濾液。。加入700 μ LMW2沖洗緩沖液，離心30s,棄去過濾液。加入700μ Ι2沖洗緩沖液，離心2min，以干燥miRNA分離柱膜。棄去過濾液。6)洗脫 RNA加入50 μ LRNase-free 水，室溫孵育 lmin,離心 lmin。_80°C保存。miRNAs 的逆轉錄運用miRNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems公司，美國)合成cDNA。具體步驟如下I)配置反應體系5 μ L的逆轉錄(RT)反應系統由I μ L探針，O. 05 μ L的dNTPs, O. 33 μ L的RTase酶，
O.5 μ L逆轉錄緩沖液，O. 063 μ LRNA 酶抑制劑，I. 387 μ LRNase-free 水和 I. 67 μ L 的 RNA 樣品組成，輕輕搖晃均勻。2)逆轉錄反應在16°C下孵育30分鐘，在42 °C下孵育30分鐘，在85 °C下孵育5分鐘，然后保持在4°C。實時定量PCR: 運用TaqMan PCR試劑盒(Applied Biosystems公司，美國)進行實時定量PCR反應。具體步驟如下I)稀釋 cDNA反轉錄完成的5μ L cDNA產物中加入28. 9 μ LRNase-free水，稍震蕩，離心。2)配置反應體系于超凈工作臺冰板上配置反應體系5 μ L的PCR反應體系包括O. 25 μ LPCR探針，2. 5 μ LTaqMan 通用 PCR Master Mix, 2. 25 μ L 稀釋的 cDNA，稍震蕩，離心。3)設置空白對照5μ L 的空白對照包括 O. 25μ L PCR探針，2· 5μ L TaqMan 通用 PCR Master Mix,2. 25 μ LRNase-free 水。4)定量 PCR 設定開始，在50°C下2min，95°C下lOmin，然后進行40個熱循環95°C下15s及60°C下lmin。每一組設置空白對照，以檢測過程中是否有污染。數據的分析采用miRNA的表達量的2_Λ Δετ算術公式計算，并采用Mann-Whitney U檢驗測試。Ρ〈0. 05視為差異有統計學意義。為了提高診斷的準確性，對實時定量PCR的結果利用多因素logistic回歸分析及ROC曲線驗證。通過曲線下面積(AUC)和95%可信區間的計算，確定目標miRNA診斷下頜前突的特異性和敏感性。用于下頜前突早期檢測的診斷試劑盒的制作miRNA診斷試劑盒的制作和操作流程是基于microarray生物芯片，實時定量PCR,Taqman探針法等技術。試劑盒包括兩種miRNA的Taqman引物探針(let_7i_3p的引物探針貨號為002172, miR-595的引物探針貨號為001987)，可由Applied Biosystems公司購得；還可以有相應PCR技術所需的常用試劑，如Taq酶，逆轉錄酶，緩沖液，dNTPs,MgCl2和DEPC水等，這些都是本領域技術人員熟知的；另外還可以含有標準品和/或對照品。此試劑盒的價值在于只需要血清/血漿而不需要其它組織樣品，通過最精簡的Taqman探針法檢測miRNAs的變化趨勢，再通過趨勢判斷是否骨性下頜前突，不僅穩定，檢測方便，且定量準確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助口腔正畸臨床醫生指導診斷，并且更有效的制定治療方案和實行預后監測。表ImiRNA序列及探針信息
權利要求
1.一種用于早期檢測下頜前突的血清/血漿miRNA標志物，其特征在于該標志物為let-7i-3p或miR-595中的一種或者兩種組合物。
2.權利要求I所述的用于早期檢測下頜前突的血清/血漿miRNA標志物在制備早期檢測下頜前突的試劑盒中的應用。
3.一種下頜前突早期檢測診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測血清/血漿中let-7i-3p或miR-595中的一種或者兩種組合物。
4.根據權利要求3所述的下頜前突早期檢測診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有let-7i-3p或miR-595中的一種或者兩種組合物的Taqman引物。
5.根據權利要求3或4所述的下頜前突早期檢測診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR反應常用的酶和/或試劑。
全文摘要
一種用于早期檢測下頜前突的血清/血漿miRNA標志物及應用，該標志物為let-7i-3p或miR-595中的一種或者兩種組合物。本發明所述的血清/血漿miRNA標志物研制出的檢測試劑或工具，為下頜前突的發生和進展機制的研究提供數據支持；通過血清/血漿miRNA標志物診斷試劑盒的研制和應用，使得下頜前突的早期檢測方便易行，為口腔正畸臨床醫生及早發現骨性下頜前突并采取有效恰當的治療方案提供有力的支持，從而有效地減少了治療時間并避免了不必要的往返治療，還能夠對病例進行治療動態評估及預后監測，從而有助于減少下頜前突的復發。
文檔編號C12N15/11GK102888465SQ20121041119
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月25日 優先權日2012年10月25日
發明者馬俊青, 王林, 張陽, 谷妍 申請人:南京醫科大學