專利名稱：人工合成人腸激酶基因及其表達純化方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體屬于一種重組人腸激酶輕鏈(HumanEnterokinaselight chain, hEKL)的制備方法,包括其工程菌細胞的構建、重組人腸激酶的表達和純化。
背景技術：
利用融合表達往往能實現目的蛋白的高效表達及分離純化。但有時目的蛋白不能以融合蛋白的形式使用，因此在目的蛋白與標簽蛋白之間設計特異的蛋白酶酶切位點，融合蛋白經過特異性的切割或斷裂，才得到完整的目的蛋白。目前常見的工具蛋白酶有凝血酶、腸激酶或Xa因子等，其中腸激酶特異性最好。
目前已經采用原核或真核表達系統成功得到了有生物活性的重組牛、小鼠等腸激酶輕鏈蛋白，但很少見關于人腸激酶輕鏈基因工程方面的研究。腸激酶是哺乳動物十二指腸的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶，由一條重鏈(82-140kD)和一條輕鏈(35-62kD)組成，通過一對二硫鍵連接。重鏈起錨定腸道細胞膜、識別蛋白質的作用；輕鏈則有全酶催化活性，是該酶的催化亞基。人腸激酶(HumanEnterokinase,hEK)除了含有以上兩個亞基外，還包括一個迷你小亞基，為異源三聚體。主要特點是對Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-丨_X(丨表示切割位點,X代表任意氨基酸)序列具有很高的識別和切割特異性。由于腸激酶酶切反應條件相對溫和寬泛，在PH值(4.5-9.5)及溫度(4-45° C)均有良好酶切活性，因此成為融合蛋白表達體系中常用的切割工具。但是天然的人腸激酶不僅來源有限，而且成本高，得率低，也容易被其它蛋白酶污染，從而導致目的產物降解。因此運用基因工程的方法生產人腸激酶已成為趨勢。國內外已有大量關于牛腸激酶研究的報道，但有關人腸激酶研究還很少。有研究表明，人腸激酶的KMt/Km值約為牛腸激酶的10倍，具有更高的切割效率，因此，如果能利用基因工程方法得到重組人腸激酶，其應用價值將比重組牛腸激酶更高。目前，人腸激酶輕鏈在畢赤酵母中的重組表達為3. 8mg/L，活力為Invitrogen商品化的腸激酶催化亞基產品EKMax 的3倍，而在大腸桿菌中的重組表達為包涵體，經變復性處理后每升發酵液可純化得到IOmg有活性的人腸激酶輕鏈蛋白，活力為EKMax 的5倍。由于腸激酶輕鏈含有9個Cys殘基，其中形成4對二硫鍵，只有一個游離的Cys殘基未參加配對，因此在重組表達時，極易形成二硫鍵錯配，導致產物以包涵體形式出現。MBP已經被證實具有很強的助溶作用，可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。這一特點尤其適用于本實驗hE&的表達與純化。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能在大腸桿菌中高效表達人腸激酶基因及其產物的表達純化方法，該方法適合于人腸激酶的大規模制備。本發明根據已報道(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的人腸激酶輕鏈的核苷酸序列和大腸桿菌偏愛密碼子的使用原則，設計編碼與人腸激酶輕鏈氨基酸序列一致的人腸激酶輕鏈的核苷酸序列，進行體外合成，在大腸桿菌中得到高效表達，并利用親和純化得到高活力的MBP-hEKL融合蛋白。本發明提供的一種人工合成的人腸激酶輕鏈(hEKj基因，它是序列表中SEQ NO I的核苷酸序列。 一種表達載體，它含有SEQ NO I的核苷酸序列，并含有Tac啟動子。一種工程菌，它含有上述的表達載體。所述工程菌是大腸桿菌。一種人工合成人腸激酶輕鏈基因在大腸桿菌中的表達純化方法，包括如下步驟(I)構建含有人工合成的hEKL基因的重組質粒pMAL-s-hEKL ；(2)將重組質粒pMAL-s-hEI^轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)細胞中，得到含有重組質粒的工程菌株；(3)將工程菌接種到LB培養基溶液中培養，當工程菌培養液濃度OD6tltol達到
O.6-0. 8時，加入終濃度為O. 1-1. OmM的IPTG，37°C誘導表達3_7小時，離心收集菌體，超聲破碎后離心，取上清，用Amylose親和層析的方法純化得到目的蛋白MBP-hEl。用10%SDS_PAGE分析純化的目的蛋白，結果顯示，本發明得到了電泳純的目的蛋白質。以Invitrogen公司的同類產品EKMax 為標準對本發明生產的MBP-hEKL活性進行標定，12%Tricine SDS-PAGE分析表明，本發明生產的MBP-hEI^的酶活力達到EKMax 的7倍。與現有技術相比，本發明的有點和效果本發明首次實現了人腸激酶在大腸桿菌中的大量可溶表達，經親和層析純化后每升發酵液可以獲得40mg帶有MBP標簽的融合蛋白MBP-hEKp活性檢測表明其活力為EKMax 的7倍，達到6. OX IO5U/μ M，無論在表達量和活力都是目前已有報道中最高的。另外我們在MBP-tag和目標蛋白之間還設計有人鼻病毒3C蛋白酶的酶切位點，可以在需要時將MBP標簽除去。而且純化得到的含有重組人腸激酶催化亞基的融合蛋白MBP-hEl有切割含有人腸激酶切割位點的蛋白質多肽和重組融合蛋白的活性。本發明提供的一種高效生產重組人腸激酶的生產方法，采用大腸桿菌表達系統，采用親和純化方法，獲得快速、簡便、穩定、高活性的重組人腸激酶輕鏈蛋白。該酶適用于生物工程、基因工程、生物化學和分子生物學等方面的研究。
四
圖I人工合成hE&基因與人體內表達的野生型基因核苷酸序列比對，圖中黑色陰影的堿基為密碼子優化后改變的堿基。圖2重組質粒pMAL-s-hEKL的PCR和酶切鑒定電泳分析泳道I為DNA makerDL5000酶切鑒定電泳分析；泳道2為重組質粒pMAL-s-hEI^的PCR鑒定；泳道3為空質粒pMAL-s ;泳道4為重組質粒pMAL-s-hEI^ ;泳道5為重組質粒pMAL-s-hEI^的BamH I單酶切電泳分析；泳道6為重組質粒pMAL-s-hEI^的BamH I/Hind III雙酶切鑒定。圖3重組質粒pMAL-s_hEKL構建示意4重組人腸激酶催化亞基表達及純化的SDS-PAGE分析圖譜泳道I為Proteinmaker;泳道 2 為 pMAL_s/BL21 (DE3)未誘導；泳道 3 為 pMAL_s/BL21 (DE3)誘導；泳道 4 為pMAL-s-hEKL/BL21 (DE3)未誘導；泳道 5 為 pMAL-s_hEKL/BL21 (DE3)誘導；泳道 6 為超聲上清；泳道 為沉淀；泳道8為經Amylose親和層析純化的MBP-hEI^圖5重組腸激酶催化亞基切割重組GST-melittin的SDS-PAGE分析圖譜泳道I為Proteinmaker ;泳道2為GST蛋白；泳道3為GSTielittin融合蛋白；泳道4-7為MBP-hEl和GST-melittin在摩爾比分別為1:1000、1:3000、1:5000和1:7000的比例下進行切割；泳道8為EKMax 和GST-melittin在摩爾比為1:1000的比例下進行切割。
五具體實施例方式I.通過查找GenBank中人腸激酶序列U09860. 1，利用大腸桿菌的密碼子偏愛性對其進行序列優化，設計編碼與人體內腸激酶輕鏈氨基酸序列一致的人腸激酶輕鏈的核苷酸序列，見序列表中SEQ ID NOl的核苷酸序列，其核苷酸與人體內野生型基因序列比較見圖
I。該人工合成人腸激酶輕鏈基因長度為708bp，編碼235個氨基酸。 2.合成下述PCR引物Fff(hEKL) 5/ -CGGGATCCATTGTTGGAGGAAGTAAT-3'；RV(hEKL) 5/ -GCAAGCTTCTCGAGCTAATGTAGAAAACTTTG-3'；其中引物FW (hEig和RV (hEKL)分別引入了 BamH I和Hind III的酶切位點，以Fff(hEKL)和RV(hEKj為PCR引物，以人工合成的人腸激酶基因為模板，用Prime STAR高保真酶進行PCR擴增hEI^基因，程序如下98°C 10秒，60°C 10秒，72°C I分鐘，30個循環，72° ClO分鐘，4°C保溫。3.用限制性內切酶BamH I、Hind III酶切hEI^ PCR產物，同樣用BamH I、HindIII酶切原核表達質粒PMAL-S (由PMAL-P2X質粒改造所得，將Factor Xa識別序列改為PreScissionProtease識別序列),酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收得到相應的核酸片段，利用T4DNA連接酶在16°C進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，37° C培養，PCR篩選陽性克隆并提取質粒進行雙酶切及PCR鑒定(見圖2)，并進行DNA序列分析確定。4.將構建好的重組質粒pMAL-s-hEI^ (見圖3)轉化至宿主細胞大腸桿菌BL21(DE3)中，得到含有重組質粒的工程菌株。5.挑取工程菌單菌落于5mL LB培養基，37°C、180轉/分鐘振蕩培養過夜，按2%接種量轉至ILLB培養基中，37°C振蕩培養至OD6tltlnm=O. 6-0. 8時，加IPTG(終濃度為O. 2mM),37°C繼續振蕩培養4小時，SDS-PAGE檢測蛋白表達情況(見圖4)。6. MBP-hEK 的分離純化8000r/min，IOmin 離心收集菌體，用 20mM Tris-HCl (含500mM NaCl, pH8. O)洗菌體兩次，再重懸于25mL相同緩沖液中，冰上超聲破碎，IlOOOr/min，4° C離心30min。收集上清，上樣于預先用平衡緩沖液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8. 0)平衡好的Amylose親和層析柱，冰浴振蕩2h。用30mL平衡緩沖液進行洗脫除去雜蛋白，然后用 IOmL 洗脫緩沖液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, IOmM Maltose, pH 8.0)將目標蛋白洗脫下來。Bradford法測定蛋白濃度。用PEG20000濃縮目的蛋白至3g/L，并將目的蛋白在透析緩沖液(20mM Tris-HCl, 50mM NaCl,2mM CaCl2,0. l%Tween-20,pH 7.4)中攪拌透析24h，所有操作均在4° C層析柜中進行。IL發酵液所得菌體經純化后最終可得到40mg純度在97%以上的MBP-hEKj濃度為3mg/mL)融合蛋白(見圖4)。
7. MBP-hEKL的活性分析以含有人腸激酶酶切位點的融合蛋白GST-Melittin為底物測定重組人腸激酶的活性。在ImL Eppendorf管中加入90 μ L GST-Melittin融合蛋白(濃度lmg/mL，純度>95%), MBP_hEKL 和底物以 1:1000、1:3000、1:5000、1:7000 的摩爾比進行切割，酶切緩沖液為20mM Tris-HCl pH 7. 4、100mM NaCl，置25° C恒溫水浴，酶切20h后Tricine SDS-PAGE檢測。MBP_hEKL活性單位標定以Invirogen公司的產品EKMax (比活力為2000U/mg，濃度為O. 5gL)為基準對純化的MBP_hE&活性進行標定，TricineSDS-PAGE圖譜基本一致的稀釋酶樣其活性相當，以此推算純化的MBP-hEI^活性(U/ μ Μ)。結果如圖5，MBP-hEl和底物以1:5000的摩爾比進行切割時，融合蛋白仍然能夠被完全酶解，得到分子量分別為26kD(GST)和2. 8kD(Melittin)的兩條帶。在1:7000時，融合蛋白的酶解率也在90%以上，與EKMax 在1:1000時酶切效果基本相當，即純化 的MBP-hEKL的比活力為EKMax (Invitrogen公司)的7倍。上述結果表明我們通過基因工程方法得到了具有生物活性的重組人腸激酶輕鏈蛋白，酶活力達到6. OX IO5U/μ M。
權利要求
1.一種人工合成的人腸激酶輕鏈(hEKL)基因，其特征在于核苷酸序列是SEQ NO I。
2.一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求I所述的人腸激酶輕鏈基因。
3.如權利要求2所述的表達載體，其特征在于，它含有Tac啟動子。
4.一種工程菌,其特征在于,它含有權利要求3所述的表達載體。
5.如權利要求4所述的工程菌，其特征在于，它是大腸桿菌。
6.如權利要求I所述的人工合成的人腸激酶輕鏈基因的表達純化方法，其特征在于，包括如下步驟 1)構建含有人工合成的hE&基因的重組質粒pMAL-s-hEI^； 2)將重組質粒pMAL-s-hEKL轉化至大腸桿菌BL21(DE3)細胞中，得到含有重組質粒的工程菌株； 3)將工程菌接種到LB培養基溶液中培養，當工程菌培養液濃度OD6tltlnm達到O.6-0. 8時，加入終濃度為O. 1-1. OmM的IPTG，37°C誘導表達3_6小時，離心收集菌體，超聲破碎后離心，取上清， 4)用Amylose親和層析的方法純化得到目的蛋白MBP-hEKp
全文摘要
本發明提供了一種能在大腸桿菌中高效表達人腸激酶基因及其產物的表達純化方法，具體是根據已報道的人腸激酶輕鏈的核苷酸序列和大腸桿菌偏愛密碼子的使用原則，設計編碼與人腸激酶輕鏈氨基酸序列一致的人腸激酶輕鏈的核苷酸序列，進行體外合成，在大腸桿菌中得到高效表達，并利用親和純化得到高活力的MBP-hEKL融合蛋白。該方法適合于人腸激酶的大規模制備。該重組蛋白能特異性識別和切割含有腸激酶切割位點的底物，能夠作為工具蛋白酶用于重組融合蛋白融合標簽的去除，且適用于生物工程制藥業、基因工程、生物化學和分子生物學等方面的研究。
文檔編號C12N15/70GK102911955SQ20121041015
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月24日 優先權日2012年10月24日
發明者鈕利喜, 楊斌盛, 石亞偉, 李嬌, 吉雪雪 申請人:山西大學