專利名稱：一種改進的植物花粉管轉化方法
技術領域：
本發明涉及生物技術遺傳育種領域，具體涉及一種改進的植物花粉管轉化方法。
背景技術：
1981年，我國的科學家周光宇首次應用花粉管通道法將外源DNA導入陸地棉中，成功培育出抗枯萎病的轉基因品種。近年來，花粉管通道法因其獨特的優勢，被科學家們廣泛的利用，進行植株的轉基因操作。該方法有以下幾個優點首先，花粉管通道法適用范圍較廣，可以應用到任何開花的植物中，并且可以在不同物種之間進行不同的基因轉移，因此其放寬了目的基因和受體植株的范圍。第二，其不依靠繁瑣的植物組織培養和誘導植物再生的漫長過程，花粉管通道法利用的是自然的生殖過程，可直接獲得轉化過的轉基因種子，簡捷、快速。第三，該方法應用于植株轉化時，大大加快了轉化速度。對于大多數植株而言，從其開花到轉基因種子的收獲平均在3-4個月的時間。即在當年即可收獲轉基因種子，并 進行檢測。第四，操作簡捷，技術易掌握，同時不需要昂貴的設備，因此可以應用于大面積植株的遺傳轉化。但是該方法在具體的實際應用中，還有一定的缺陷，即該方法轉化效率不高，在轉化過程中，外源質粒DNA易降解。DNA保護劑主要是一類可以保護抗原的物質，特別是DNA、RNA不受體內酶的分解。DNA保護劑包括氫氧化鋁明膠、磷酸鈣和乳油保護劑。而在醫學中，鋁鹽佐劑是被允許應用于人類的佐劑。利用這類鋁鹽膠體，抗原會跟一個不溶的凝膠沉淀劑結合，或者經過相互的電作用形成凝膠粒子。該保護劑的作用原理是因其是一個暫時的儲存庫，緩釋是其非常重要的一個功能。它可以將抗原包裹住，可以避免抗原分子被降解，同時可以避免受體內的清除作用而喪失。乳油保護劑一般是用礦物油、穩定劑及乳化劑(如TWeen20、Tween80及SpanSO)按照一定的比例進行混合，然后與抗原混合制成。這類保護劑是一種油包水的乳齊U，它可以作為一個保存庫，避免抗原被水相中的機體水解，進而到達抗原被保護的目的。而傳統的花粉管通道法，大多用I X SSC溶液作為回溶劑，回溶目的基因或質粒。
發明內容
本發明的目的是為解決花粉管通道法在轉化過程中，外源質粒DNA易降解，轉化效率不高的問題，而提供一種改進的植物花粉管轉化方法。一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于將外源質粒DNA重懸于質粒DNA保護劑中，制成外源質粒DNA的混合液；濃度為0. 8-1. 2 u g/y L，然后利用植物花粉管通道法轉化到植物中；
所述的外源質粒DNA保護劑，它是氫氧化鋁溶膠保護劑、磷酸鈣保護劑和Tween20保護劑中的一種；
所述的外源質粒DNA的濃度為I y g/ y L。所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的
(I)在一支玻璃試管中加入2-4mL 1%氯化鋁溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；
(2)棄上清，用蒸餾水清洗沉淀3-5次，采用傾析法除去水分，最后一次用過濾法使洗液與沉淀分離；
(3)將沉淀轉入150mL燒杯中，加入蒸懼水20-80 mL,攪拌并加熱煮沸。期間加入
0.1-0. 2 mL 0. I mol/L HCl溶液，不斷攪拌，即可獲得氫氧化鋁溶膠；
(4)氫氧化鋁溶膠重懸外源質粒DNA。所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的
(1)用滅菌蒸餾水5-15u L重懸外源質粒DNA，使其濃度為I y g/ y L，再加入50-60U L 2 mol/L CaCl2 溶液混勻；
(2)離心，將上清液取出，加入到400-450UL滅菌蒸餾水中；得外源質粒DNA-CaCl2溶
液；
(3)取一個2mL滅菌的離心管，向其中加入500 u L, pH6. 95-7. 05，2XHEPES緩沖液，向HEPES緩沖液中以吹氣的方式逐滴滴入外源質粒DNA-CaC12溶液；
(4)將試管放于37°C水浴中孵育3-5min，可見乳白色混濁出現；
(5)10000 r/min離心3 min,棄上清；所得的混合物即為磷酸I丐-外源質粒DNA。所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的
(1)采用滅菌蒸餾水與蔗糖，配成濃度為8%的蔗糖溶液，115°C滅菌15-20min ；
(2)取上述蔗糖溶液與TWeen20混合，制成濃度為5%的TWeen20保護劑；
(3)取5%的Tween20保護劑10-20u L外源質粒DNA。本發明提供了一種改進的植物花粉管轉化方法，分別采用氫氧化鋁溶膠、磷酸鈣和TWeen20作為外源質粒DNA保護劑，利用植物花粉管通道法轉化外源基因，受體煙草和大豆GUS活性組織化學染色結果表明，以氫氧化鋁溶膠作為DNA保護劑的gus陽性率分別為
11.1%和3. 76% ;以磷酸鈣作為DNA保護劑的gus陽性率分別為8. 89%和2. 91% ;以Tween20作為DNA保護劑的gus陽性率分別為10. 0%和I. 41% ;以IXSSC溶液作為DNA保護劑的gus陽性率分別為7. 78%和I. 97%，提高了轉化率。
圖I轉基因煙草抗性植株；
圖2轉基因大豆抗性植株；
圖3煙草抗性株PCR產物檢測結果；
圖4大豆抗性株PCR產物檢測結果；
圖5轉基因煙草根部、葉片和種子GUS活性組織的化學染色結果，其中，5-A為根部；5-B為葉片；5-C為種子；
圖6轉基因大豆種子和葉片GUS活性組織的化學染色結果，其中，6-A為種子；6-B為葉片。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
具體實施例方式 實施例I植物表達載體PCAMBIA1301質粒DNA的提取
按照質粒DNA常規提取方法-堿裂解法，從含有植物表達載體pCAMBIA1301的大腸桿菌中提取質粒DNA。實施例2氫氧化鋁溶膠保護劑的制備
(1)在一支玻璃試管中加入2-4mL1%氯化鋁溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；
(2)棄上清，用蒸餾水清洗沉淀3-5次，采用傾析法除去水分，最后一次用過濾法使洗液與沉淀分離；
(3)將沉淀轉入150mL燒杯中，加入蒸懼水20-80 mL,攪拌并加熱煮沸。期間加入
0.1-0. 2 mL 0. I mol/L HCl溶液，不斷攪拌，即可獲得氫氧化鋁溶膠； (4)取少許氫氧化鋁溶膠重懸實施例I中所提取的pCAMBIA1301的質粒DNA沉淀，獲得的混合物即為氫氧化鋁溶膠-pCAMBIA1301，pCAMBIA1301的質粒DNA的濃度為0. 8-1. 2y g/ y L0實施例3磷酸鈣保護劑的制備
(I)用滅菌蒸餾水5-15 U L重懸實施例I所提取的pCAMBI1301的質粒DNA沉淀，使其濃度為I Ug/yL，再加入50-60 UL 2 mol/L CaC12溶液混勻，此時會有少量混濁物質出現。(2)12000 r/min離心10 min,將上清液取出，加入到400-450 U L滅菌蒸懼水中，此即稱為pCAMBIA1301-CaC12溶液。(3)取一個2 mL滅菌的離心管，向其中加入500 u L 2XHEPES緩沖液(pH6. 95-7. 05)，向HEPES緩沖液中以吹氣的方式逐滴滴入pCAMBIA1301_CaC12溶液。(4)將試管放于37°C水浴中孵育3-5 min，可見乳白色混濁出現。(5) 10000 r/min離心3 min,棄上清。所得的混合物即為磷酸I丐_pCAMBIA1301,PCAMBIA1301 的質粒 DNA 的濃度為 0. 8-1. 2 u g/u L0實施例4 Tween20保護劑的制備
(I)采用滅菌蒸餾水與蔗糖，配成濃度為8%的蔗糖溶液，115°C滅菌15-20 min。(2)取上述蔗糖溶液與TWeen20混合，制成濃度為5%的TWeen20保護劑。(3)取5%的Tween20保護劑10_20 u L重懸實施例I所提取的pCAMBIA1301的質粒DNA沉淀，使其濃度為0. 8-1. 2 ug/u L0實施例5三種不同DNA保護劑處理的質粒DNA pCAMBIA1301花粉管通道轉化方法 分別采用大豆和煙草作為受試材料。( I)大豆花粉管通道轉化法 ①大豆材料種植
將事先準備好的大豆種子在試驗田內播種長至盛花期。②選擇大豆自花授粉6 h后進行質粒DNA導入，標志是花冠完全開放后的花。③使用鑷子把一個節點部位的其他花朵去掉，剩余1-2朵完全開放的花。④用鑷子將剩余花朵的萼片和翼瓣出去，用小剪刀把突出的柱頭剪去部分。⑤使用微量注射器將5-10 UL實施例2、3、4制備的質粒DNA溶液滴加到切口處。同時用IXSSC緩沖液重懸的質粒DNA做對照進行同樣處理。⑥掛好記錄有質粒DNA樣品、導入時間及受體植株品種的標牌。⑦待20-30 min后，重新滴加一次。
⑧大豆在進行外源基因導入3-7 d后，定期去雜，保證轉化的花朵可以結實。每種不同保護劑混合的質粒DNA分別導入大豆100棵。 (2)煙草花粉管通道轉化法 ①煙草材料種植
由于煙草種子過小，先在MS培養基培育無菌苗，25 d后，待無菌苗根系發育良好，先煉苗5-7 d，然后移栽至小花盆中。待其長至25 cm左右，移栽至溫室中。在其盛花期進行目的基因的導入。②在煙草授粉后10 h，用剪刀在子房上部I cm處剪去花柱。③使用微量注射器將5-10 UL實施例2、3、4制備的質粒DNA溶液滴加到切口處。同時用IXSSC緩沖液重懸的質粒DNA做對照進行同樣處理。
④掛好記錄有質粒DNA樣品、導入時間及受體植株品種的標牌，每種DNA保護劑分別轉化煙草90棵。實施例6轉基因植株的檢測
(I)轉基因植株抗性篩選
將收獲的煙草和大豆種子分別放入含有潮霉素濃度為10 mg/L的MS篩選培養基中進行抗性篩選，如圖1、2所示。( 2 )抗性植株的PCR檢測
①根據植物基因DNA的常規提取方法-CTAB法分別提取抗性植株和未轉化植株的基因組 DNA。②植物表達載體PCAMBIA1301上含有gus基因(￠-葡萄糖苷酸酶基因)，長度2000bp，選取其中長度為1007 bp的部分序列設計特異性引物，以提取植株基因組DNA為模板，擴增gus基因，其中抗性植株為實驗組，未轉化植株為陰性對照組，并以PCAMBIA1301的質粒DNA作為陽性對照組。③PCR產物經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖3、4所示，隨機檢測的5株煙草和大豆抗性植株均擴增出了 1007 bp的特異性條帶，且同陽性對照組的位置相同，而陰性對照組未見1007 bp的特異性條帶。結果表明，在轉基因陽性植株中含有gus基因，其來源為花粉管通道轉化法導入的。( 3 )⑶S活性組織的化學染色試驗
對PCR檢出陽性的煙草植株的葉片、根部和大豆植株的種子和葉片進行常規GUS活性組織化學染色。如圖5所示，轉基因煙草的葉片(5-A)、根部(5-B)種子(5-C)均檢測出⑶S活性，而未進行轉化的煙草各個部位皆未能染色，說明其不具有GUS活性。如圖6所示，轉基因大豆的種子(6-A)、葉片(6-B)均檢測出GUS活性，而未進行轉化的煙草各個部位皆未能染色，說明其不具有GUS活性。結果表明，gus基因在煙草和大豆植株內均獲得表達，夕卜源DNA成功轉入受體植株中。對實施例2、3、4制備的DNA保護劑轉化的受體煙草和大豆⑶S活性組織化學染色結果表明，以氫氧化鋁溶膠作為DNA保護劑的gus陽性率分別為11. 1%和3. 76% ;以磷酸鈣作為DNA保護劑的gus陽性率分別為8. 89%和2. 91% ；以Tween20作為DNA保護劑的gus陽性率分別為10. 0%和I. 41% -M IXSSC溶液作為DNA保護劑的gus陽性率分別為7. 78%和
I.97%，見表 1、2。
表I三種DNA保護劑使質粒DNA轉入煙草的轉化率
權利要求
1.一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于將外源質粒DNA重懸于質粒DNA保護劑中，制成外源質粒DNA的混合液；濃度為0. 8-1. 2 ug/UL,然后利用植物花粉管通道法轉化到植物中。
2.根據權利要求I所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于所述的外源質粒DNA保護劑，它是氫氧化鋁溶膠保護劑、磷酸鈣保護劑和TWeen20保護劑中的一種。
3.根據權利要求I或2所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于所述的外源質粒DNA的濃度為I y g/ y L。
4.根據權利要求I所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的 (1)在一支玻璃試管中加入2-4mL1%氯化鋁溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀； (2)棄上清，用蒸餾水清洗沉淀3-5次，采用傾析法除去水分，最后一次用過濾法使洗液與沉淀分離； (3)將沉淀轉入150mL燒杯中，加入蒸餾水20-80 mL，攪拌并加熱煮沸； 期間加入0. 1-0. 2 mL 0. I mol/L HCl溶液，不斷攪拌，即可獲得氫氧化鋁溶膠； (4)氫氧化鋁溶膠重懸外源質粒DNA。
5.根據權利要求I所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的 (1)用滅菌蒸餾水5-15u L重懸外源質粒DNA，使其濃度為I y g/ y L，再加入50-60U L 2 mol/L CaCl2 溶液混勻； (2)離心，將上清液取出，加入到400-450UL滅菌蒸餾水中；得外源質粒DNA-CaCl2溶液； (3)取一個2mL滅菌的離心管，向其中加入500 u L, pH6. 95-7. 05，2XHEPES緩沖液，向HEPES緩沖液中以吹氣的方式逐滴滴入外源質粒DNA-CaC12溶液； (4)將試管放于37°C水浴中孵育3-5min，可見乳白色混濁出現； (5)10000 r/min離心3 min,棄上清；所得的混合物即為磷酸I丐-外源質粒DNA。
6.根據權利要求I所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的 (1)采用滅菌蒸餾水與蔗糖，配成濃度為8%的蔗糖溶液，115°C滅菌15-20min ； (2)取上述蔗糖溶液與TWeen20混合，制成濃度為5%的TWeen20保護劑； (3)取5%的Tween20保護劑10-20u L外源質粒DNA。
全文摘要
本發明公開了一種改進的植物花粉管轉化方法，分別采用氫氧化鋁溶膠、磷酸鈣和Tween20作為外源質粒DNA保護劑，利用植物花粉管通道法轉化外源基因，受體煙草和大豆GUS活性組織化學染色結果表明，以氫氧化鋁溶膠作為DNA保護劑的gus陽性率分別為11.1%和3.78%；以磷酸鈣作為DNA保護劑的gus陽性率分別為8.89%和2.91%；以Tween20作為DNA保護劑的gus陽性率分別為10.0%和1.41%；以1×SSC溶液作為DNA保護劑的gus陽性率分別為7.78%和1.97%，解決了植物花粉管通道法轉化率低的問題，提高了轉化率。
文檔編號C12N15/82GK102864168SQ201210406418
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月23日 優先權日2012年10月23日
發明者王丕武, 付永平, 張君, 曲靜, 姚丹, 馬建, 王鑫雨, 單睿, 關淑艷 申請人:吉林農業大學