專利名稱：一種測定赭曲霉毒素a的適配體傳感器的構建方法
技術領域：
一種測定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構建方法，屬于生物傳感器檢測技術領域。
背景技術：
赭曲霉毒素(Ochratoxins)是曲霉屬和青霉屬的幾個種產生的一組結構類似的有毒代謝產物，有A、B、C、D四種化合物，包括7種化學結構相似的化合物，其中毒性最大、分布最廣、產毒量最高、對農作物的污染最重、與人類健康關系最密切的是赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)。主要產生菌是赫曲霉(Asperillus ochraceus)、純綠霉(Penicillium verrucosum),對食品污染的范圍較廣,廣泛存在于谷物、咖啡豆、豆類、葡萄·干、啤酒、葡萄汁等各類食物和飼料中，谷物及其副產品是OTA的主要來源。赭曲霉毒素A具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、以及致畸、致癌和致突變作用等多種毒性，對動物和人體健康有很大的潛在危害。因此世界各國均重視對赭曲霉毒素A的檢測和控制，并制定了相關限量標準，以便于確保食品安全和消除國際貿易中的技術壁壘。目前，赭曲霉毒素A的殘留分析方法主要有化學分析法和免疫化學分析法。薄層層析法(TLC)的優點是方法簡單，使用的試劑價格便宜，但是存在靈敏度較差，所需試劑繁多，檢測周期長，重現性不好和無法實現自動化等缺點，已不能滿足現代檢測的要求。而液相-質譜聯用法(LC-MS)具有靈敏度高、檢出率高等特點，其設備昂貴，操作繁瑣，以及長時間的樣本前處理過程，導致檢測成本高，周期長，無法滿足大批量樣本快速篩查的要求。免疫分析技術具有較高的靈敏度和特異性，但是高質量抗體的制備過程需要較長的周期，交叉反應率的存在會大大影響檢測結果的準確度。適配體是一類在體外篩選的能與相應目標物專一并緊密結合的一類單鏈寡核苷酸序列，具有熱穩定性、可重用性和易于化學合成等優點，與抗體相比具有更高的特異性和親和力，甚至能識別單抗所不能區分的靶標分子單個取代基修飾的極細微差別。以赭曲霉毒素A的適配體代替抗體作為赭曲霉毒素A識別探針，其體外篩選、體外制備的特點能夠有效克服抗體制備周期長、生產成本高、技術難度大、批間差異大、克隆株(細胞)難以有效保存的缺點。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)是對DNA進行擴增的一種方法，同時可以精確靈敏的定量樣品中極微量的DNA的含量。因此，基于RT-qPCR超強的擴增效應以及定量分析，以DNA作為檢測的標記分子，可以帶來更多的優勢，如檢測限低、靈敏度高、特異性好、操作簡單以及高通量分析等。適配體高特異性高親和性結合目標物的特征結合RT-PCR的擴增和定量效應，通過DNA擴增產生的熒光信號，間接測定待檢目標物的含量。本方法的最大優點在于可以實現赫曲霉毒素A飛克級的檢測水平，是目如實現赫曲霉毒素A檢測靈敏度最聞的一種方法
發明內容
本發明的目的在于提供一種測定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構建方法，該適配體生物傳感器，通過適配體的識別作用和PT-qPCR的擴增與定量效應，通過DNA擴增產生的熒光信號對赭曲霉毒素A進行間接檢測。本發明的技術方案一種測定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構建方法，包括鏈霉親和素包被PCR管，適配體與其部分互補的DNA片段雜交并固定在PCR管表面，適配體傳感器的構建，具體步驟為
(1)鏈霉親和素包被PCR管
首先將PCR管用50 μ L質量濃度O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超純水將PCR管洗滌三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸鹽緩沖液稀釋的12. 5ng/mL的鏈霉親和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育結束后再用上述碳酸鹽緩沖液洗滌三次， 每次3min,以去除未結合的鏈霉親和素；
(2)適配體與其部分互補的DNA片段雜交并固定在PCR管表面
用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O雜交緩沖液將適配體和部分互補于適配體的DNA片段分別稀釋到50nM和ΙΟΟηΜ，并將兩者以I: I的體積比充分混合，將混合液于每個PCR管加入30 μ L，并在37°C條件下孵育40min，以使互補雙鏈充分雜交并結合到PCR管表面；
所述單鏈DNA適配體片段和部分互補于適配體的DNA片段序列分別為
適配體5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’，
與適配體部分互補的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA
TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ；
(3)適配體傳感器的構建
在步驟(2)包被好的每個PCR管中，分別加入30 μ L 5X l(T6ng/g 5ng/g的十倍梯度稀釋的赭曲霉毒素A標準品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和適配體充分結合,結合緩沖液為含 10 mM Tris, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, pH 7. O 的緩沖液，反應結束后，再用結合緩沖液洗滌三次，每次3min，最后將PCR管拍打干凈，以去除未結合的赭曲霉毒素A和雙鏈變性釋放出的部分互補于適配體的DNA片段；
每個PCR管在30 μ L的體系中進行反應，此體系由以下反應物質組成各O. 6 μ L終濃度均為2 μ M的上游引物和下游引物，I. 8 μ L 20 XEvaGreen染料(購自上海開放生物科技有限公司，上海市徐匯區田林路192號)，3μ L終濃度為ImM的dNTP混合液，3 μ L 10XPCR緩沖液，O. 3 μ L濃度為5U的Taq DNA聚合酶和超純水補足30 μ L ;將反應物充分混勻，最后用熒光定量PCR儀CFX-96進行測定，擴增條件為首先95°C預變性30s，然后95°C變性5s，57°C退火和延伸30s，總共為39個循環，得到互補于適配體的DNA片段的擴增曲線；再從65°C升溫至95°C，每O. 5°C讀取一次熒光值，使得擴增后的雙鏈DNA變性，得到DNA熔解曲線；
上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’，
下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3 ’。本發明的有益效果本發明提供了一種適配體生物傳感器，通過適配體高親和結合目標物和PT-qPCR的擴增與定量效應，通過DNA擴增產生的熒光信號對赭曲霉毒素A進行間接檢測。
圖I赭曲霉毒素A標準曲線；
圖2互補于適配體的DNA片段擴增得到的擴增曲線。圖3擴增后的雙鏈DNA熔解得到的熔解曲線。
具體實施例方式實施例I
(1)鏈霉親和素包被PCR管 首先將PCR管用50 μ L O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超純水將PCR管洗滌三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸鹽緩沖液稀釋的12. 5ng/mL的鏈霉親和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育結束后再用上述碳酸鹽緩沖液洗滌三次，每次3min,以去除未結合的鏈霉親和素；
(2)適配體與其部分互補的DNA片段雜交并固定在PCR管表面
用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O雜交緩沖液將適配體和部分互補于適配體的DNA片段分別稀釋到50nM和ΙΟΟηΜ，并將兩者以I: I的體積比充分混合，將混合液于每個PCR管加入30 μ L，并在37°C條件下孵育40min，以使互補雙鏈充分雜交并結合到PCR管表面；
所述單鏈DNA適配體片段和部分互補于適配體的序列分別為
適配體5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’，
部分互補于適配體的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA
TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ；
(3)適配體傳感器的構建
在步驟(2)包被好的每個PCR管中，分別加入30 μ L 5Χ l(T6ng/g 5ng/g的十倍梯度稀釋的赭曲霉毒素A標準品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和適配體充分結合,結合緩沖液為含 10 mM Tris、120 mM NaCl,5 mM KCl,20 mM CaCl2、pH 7.0 的緩沖液，反應結束后，再用結合緩沖液洗滌三次，每次3min，最后將PCR管拍打干凈，以去除未結合的赭曲霉毒素A和雙鏈變性釋放出的部分互補于適配體的DNA片段；
每個PCR管在30 μ L的體系中進行反應，此體系由以下反應物質組成各O. 6 μ L終濃度均為2 μ M的上游引物和下游引物，I. 8 μ L 20 XEvaGreen染料(購自上海開放生物科技有限公司，上海市徐匯區田林路192號)，3μ L終濃度為ImM的dNTP混合液，3 μ L 10XPCR緩沖液，O. 3 μ L濃度為5U的Taq DNA聚合酶和超純水補足30 μ L ;將反應物充分混勻，最后用熒光定量PCR儀CFX-96進行測定，擴增條件為首先95°C預變性30s，然后95°C變性5s, 57°C退火和延伸30s，總共為39個循環，得到互補于適配體的DNA片段的擴增曲線；再從65°C升溫至95°C，每O. 5°C讀取一次熒光值，使得擴增后的雙鏈DNA變性，得到DNA熔解曲線；
上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’，下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3’。(4)檢測靈敏度研究
根據RT-qPCR擴增得到的DNA擴增曲線，在擴增曲線的指數期選取合適的閾值，得到每個赭曲霉毒素A濃度下對應的Ct值，以赭曲霉毒素A的濃度為橫坐標，Ct值為縱坐標做出一條標準曲線，根據標準曲線計算出赭曲霉毒素A的檢測限為lfg/g。(5)特異性研究
以玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、黃曲霉毒素BI、伏馬菌素代替赭曲霉毒素A作為檢測目標物進行特異性研究，加入的四種毒素的濃度和上述赭曲霉毒素A的加入濃度相同，操作方法同赭曲霉毒素A檢測的操作方法一致，獲得檢測四種毒素的DNA擴增曲線；所得每種毒素濃度下的擴增曲線與未加入任何目標物的空白樣的擴增曲線位于同一個位置，Ct值沒有發生變化，從而得出檢測三聚氰胺的DNA-三聚氰胺抗體偶聯物沒有識別頭孢菌素，此方法的 特異性良好。(6)樣品添加回收研究
在IOmL陰性紅酒樣品加入O. I g聚乙烯吡咯烷酮以使紅酒樣品澄清，通過過濾去除沉淀物，將處理后的樣品稀釋10倍,分別添加5X 10_6 ng g \ 1X10_4 ng g SO. 001 ngg 1^O. 01 ng g SO. I ng g \ I ng g ng g 1水平的赭曲霉毒素A標準品，用此方法測定標準品的添加回收率，最終得到的回收率范圍在99% 112%，可以用于實際樣品的測定。
權利要求
1.一種測定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構建方法，其特征在于包括鏈霉親和素包被PCR管，適配體與其部分互補的DNA片段雜交并固定在PCR管表面，適配體傳感器的構建；具體步驟為 (1)鏈霉親和素包被PCR管 首先將PCR管用50 μ L質量濃度O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超純水將PCR管洗滌三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸鹽緩沖液稀釋的12. 5ng/mL的鏈霉親和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育結束后再用上述碳酸鹽緩沖液洗滌三次，每次3min,以去除未結合的鏈霉親和素； (2)適配體與其部分互補的DNA片段雜交并固定在PCR管表面 用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O雜交緩沖液將適配體和部分互補于適配體的DNA片段分別稀釋到50nM和ΙΟΟηΜ，并將兩者以I: I的體積比充分混合，將混合液于每個PCR管加入30 μ L，并在37°C條件下孵育40min，以使互補雙鏈充分雜交并結合到PCR管表面； 所述單鏈DNA適配體片段和部分互補于適配體的DNA片段序列分別為 適配體5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’， 與適配體部分互補的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ； (3)適配體傳感器的構建 在步驟(2)包被好的每個PCR管中，分別加入30 μ L 5Xl(T6ng/g 5 ng/g的十倍梯度稀釋的赭曲霉毒素A標準品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和適配體充分結合,結合緩沖液為含 10 mM Tris、120 mM NaCl,5 mM KCl,20 mM CaCl2、pH 7.0 的緩沖液，反應結束后，再用結合緩沖液洗滌三次，每次3min，最后將PCR管拍打干凈，以去除未結合的赭曲霉毒素A和雙鏈變性釋放出的部分互補于適配體的DNA片段； 每個PCR管在30 μ L的體系中進行反應，此體系由以下反應物質組成各O. 6 μ L終濃度均為2μ M的上游引物和下游引物，I. 8μ L 20 X EvaGreen染料，3 μ L終濃度為ImM的dNTP混合液，3yL 10XPCR緩沖液，O. 3μ L濃度為5U的Taq DNA聚合酶和超純水補足30 μ L ;將反應物充分混勻，最后用熒光定量PCR儀CFX-96進行測定，擴增條件為首先95°C預變性30s ;然后95°C變性5s、57°C退火和延伸30s，總共為39個循環；得到互補于適配體的DNA片段的擴增曲線；再從65°C升溫至95°C，每O. 5°C讀取一次熒光值，使得擴增后的雙鏈DNA變性，得到DNA熔解曲線； 上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’， 下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3’。
全文摘要
一種測定赭曲霉毒素A的適配體傳感器的構建方法，屬于生物傳感器檢測技術領域。本發明包括鏈霉親和素包被PCR管，適配體與其部分互補的DNA片段雜交并固定在PCR管表面，適配體傳感器的構建。本發明提供了一種與赭曲霉毒素A高特異性高親和力結合的單鏈DNA適配體和部分互補于適配體的DNA片段，通過適配體與赭曲霉毒素A的識別結合，誘導適配體構象的改變從而導致互補于適配體的DNA片段釋放，以互補于適配體的片段作為PCR擴增模板，通過擴增后的熒光信號對赭曲霉毒素A進行檢測。本發明方法能實現對赭曲霉毒素A超靈敏檢測，檢測限低、檢測靈敏度高、特異性好，為痕量赭曲霉毒素A以及其他有害物質的檢測提供了一種有效的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102912020SQ20121040003
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月20日 優先權日2012年10月20日
發明者胥傳來, 徐麗廣, 匡華, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊 申請人:江南大學