專利名稱：一種檢測h3n8型禽流感病毒的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用納米金顆粒檢測H3N8型禽流感病毒DNA或RNA經環介導等溫核酸擴增技術擴增后產物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術領域。
背景技術：
對基因(DNA)及其轉錄產物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于疾病的早期診斷和治療以及在在衛生防疫、環境監測、檢驗檢疫等領域都具有十分重要的意義。以往在這方面較為準確靈敏的檢測方法有熒光標記法、放射性標記等方法，這些方法都需要復雜的操作和特殊的設備，應用范圍很窄。1993年PE公司的Dr. Kary B. Mullis發明了聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR。隨后PCR技術大規模的應用于生物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進入了新的時代，Dr. Mullis為此還獲得了 1993年的諾貝爾化學獎。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準確性高、操作較簡單等優點，但由于其反應進行和產品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術的使用一直被限定在專業的實驗室和醫院里。2001年日本榮研化學株式會社研制出了一種新型DNA擴增方式，環介導等溫核酸擴增技術(LAMP)可以在恒溫條件下實現DNA的高效快速擴增，該方法反應條件簡單，DNA擴增效率高，因此在核酸檢測方面具有明顯優勢。但是對LAMP擴增制備的DNA產物使用常規的檢測方法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴增所帶來的假陽性問題，而且需要特殊的儀器，因此限制了 LAMP技術的實際應用。禽流感，全名鳥禽類流行性感冒，是由病毒引起的動物傳染病，通常只感染鳥類，少見情況會感染豬。禽流感病毒高度針對特定物種，但在罕有情況下會跨越物種障礙感染人。自從1997年在香港發現人類也會感染禽流感之后，此病癥引起全世界衛生組織的高度
關注。其后，本病一直在亞洲區零星爆發，但在2003年12月開始，禽流感在東亞多國-
主要在越南、韓國、泰國——嚴重爆發，并造成越南多名病人喪生。直到2005年中，疫癥不但未有平息的跡象，而且還不斷擴散。現時遠至東歐多個國家亦有案例。根據核蛋白的抗原性分類，禽流感病毒則屬甲型流感病毒，甲型流感病毒是根據位于其套膜上的血凝素及神經氨酸酶的抗原性分為若干亞型，血凝素(H)有16個亞型；神經氨酸酶(N)有9個亞型。所有的這些亞型都可以感染鳥，在禽類中高致病性的屬于H5、H7亞型。典型的雞禽流感病毒是H3N8，造成1983年、1984年在美國東部大流行的是H5N2。目前東南亞地區出現的人類感染是H5N1型。1997年發現的H5N1型毒株被認定是當時流行性感冒的病源。1999年，香港出現過H9N2型禽流感的人類感染，2003年，荷蘭出現過H7N7型禽流感的人類感染；2006年I月，美國出現H3N2。H3N8型禽流感病毒的對人類的生活影響很大，但是目前針對H3N8型禽流感病毒缺乏簡單、快速、便于使用和成本低廉的檢測方法。
發明內容
本發明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測H3N8型禽流感病毒專有的基因片段經環介導等溫核酸擴增技術擴增后產物DNA的試劑盒，從而判定H3N8型禽流感病毒的存在與否。本發明采用如下采用下述技術方案來解決上述問題本發明試劑盒包括兩部分(O標記有可以識別H3N8型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒DNA或先經過逆轉錄過程后再擴增待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒RNA的環介導等溫核酸擴增體系。本發明中，試劑盒的工作原理為I.納米金顆粒標記有能識別H3N8型禽流感病毒特定序列的分子探針，分子探針被固定在納米金顆粒的表面。2.待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒DNA分子或H3N8型禽流感病毒RNA經環介導等溫核酸擴增技術大量復制或先經逆轉錄過程后大量復制，H3N8型禽流感病毒的目標片段被放大109倍，產生的擴增產物DNA具有多重重復序列。3.混合納米金顆粒和環介導等溫核酸擴增體系，H3N8型禽流感病毒經環介導等 溫核酸擴增技術以后的產物DNA與納米金顆粒上能識別H3N8型禽流感病毒特定序列的分子探針雜交。4.納米金顆粒沿環介導等溫核酸擴增技術產物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所示)，進而引發納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據顏色變化可以判斷待測樣品是否具有H3N8型禽流感病毒DNA或RNA。本發明中，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別H3N8型禽流感病毒的特定序列。本發明中，待檢測樣品中環介導等溫核酸擴增技術的擴增對象可以是H3N8型禽流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。本發明中，納米金顆粒探針和H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交可以和環介導等溫核酸擴增反應在相同反應條件下、相同反應容器中同時進行。本發明中，納米金顆粒探針和H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交可以發生在溶液中或者固體表面。本發明中，納米金顆粒探針與H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交引發溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計等光學儀器檢測。本發明中，分子探針是指可以識別H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質，化學分子。本發明中，相同反應條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應時間等。本發明的優勢本發明試劑盒結合環介導等溫核酸擴增技術和生物納米技術，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準確、成本低廉、不需要專業儀器設備的方法，可以廣泛應用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環境監測、檢驗檢疫，生物技術等領域的高靈敏度的H3N8型禽流感病毒檢測。
圖I為標記有分子探針的納米金顆粒與H3N8型禽流感病毒經環介導等溫核酸擴增技術以后的產物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿柯H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA分子鏈形成聚集體。
具體實施例本發明試劑盒包括2管溶液，一管中是標記有可以識別H3N8型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒溶液50 μ 1，一管中是250 μ I可以擴增待檢測樣品中的Η3Ν8型禽流感病毒DNA或先經過逆轉錄過程后再擴增待檢測樣品中的Η3Ν8型禽流感病毒RNA的環介導等溫核酸擴增體系。納米金顆粒溶液中含有直徑為20 nm的納米金顆粒，濃度為I. 2 nM，納米金顆粒表面標記有疏基修飾的DNA探針。環介導等溫核酸擴增體系成分如下0. 2 “11 3和83引物，1.6 μ M FIP和BIP引物，O. 4 M betaine (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO), 10 mM MgS04, I. 4 mM dNTPs,IX ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 80 U Bst DNApolymerase (New England Biolabs), 6. 25 U AMV 逆轉錄酶(Invitrogen, Carlsbad,CA)。巰基修飾的DNA探針序列
5’-ATGACTCAAATGTCAAGAACAAAAAAAAAAA-SH-3’ 。H3N8型禽流感病毒的F3弓丨物序列
5’-CTTTACGATAAGGTCAGACT-3’ 。H3N8型禽流感病毒的B3弓丨物序列
5’-TACAGCTTAAGGATAATGCAA-3’ 。H3N8型禽流感病毒的FIP引物序列
5’-AAGAGTTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGT-3’ 。H3N8型禽流感病毒的BIP引物序列
5’-AATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTA-3’ 。操作過程如下1.向裝有環介導等溫核酸擴增體系的管中加入10 μ I提取的核酸或者混合樣品。2.將裝有混合物的管放入60° C的水浴中30分鐘。3.再向步驟2中的管中加入納米金顆粒溶液，此時混合后的溶液為紅色。4. 60° C水浴反應15分鐘。觀察反應后管中溶液的顏色，溶液保持紅色不變則不含有Η3Ν8型禽流感病毒感染特異性RNA或Η3Ν8型禽流感病毒DNA ;如果溶液變為淺紫色，則判定樣本中含有Η3Ν8型禽流感病毒感染特異性的RNA或Η3Ν8型禽流感病毒DNA。
權利要求
1.一種用納米金顆粒檢測H3N8型禽流感病毒經環介導等溫核酸擴增技術擴增后產物DNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下部分(I)標記有可以識別H3N8型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒DNA或先經過逆轉錄過程后再擴增待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒RNA的環介導等溫核酸擴增體系。
2.根據權利要求1，該試劑盒的工作原理為(I)用環介導等溫核酸擴增技術擴增待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒DNA或先經過逆轉錄過程后用環介導等溫核酸擴增技術擴增待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒RNA ； (2)納米金顆粒探針與環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交；(3)雜交引發納米金顆粒聚集，導致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測樣品是否含有H3N8型禽流感病毒DNA或RNA。
3.根據權利要求1，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別H3N8型禽流感病毒的特定序列。
4.根據權利要求2，待檢測樣品中環介導等溫核酸擴增技術的擴增對象可以是H3N8型禽流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根據權利要求2，納米金顆粒探針和H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交可以和環介導等溫核酸擴增反應在相同反應條件下、相同反應容器中同時進行。
6.根據權利要求2，納米金顆粒探針和H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交可以發生在溶液中或者固體表面。
7.根據權利要求2，納米金顆粒探針與H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交引發溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計等光學儀器檢測。
8.根據權利要求3，分子探針是指可以識別H3N8型禽流感病毒環介導等溫核酸擴增技術產物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質，化學分子。
9.根據權利要求4，相同反應條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應時間等。
全文摘要
本發明涉及一種用納米金顆粒檢測H3N8型禽流感病毒DNA經環介導等溫核酸擴增技術擴增后產物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術領域。本發明結合環介導等溫核酸擴增技術和生物納米技術，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準確、不需要專業儀器設備的方法，可以廣泛應用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環境監測、檢驗檢疫，生物技術等領域的高靈敏度的H3N8型禽流感病毒檢測。本發明試劑盒包括兩部分(1)標記有可以識別H3N8型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒DNA或先經過逆轉錄過程后再擴增待檢測樣品中的H3N8型禽流感病毒RNA的環介導等溫核酸擴增體系。
文檔編號C12Q1/70GK102851404SQ201210399819
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者不公告發明人 申請人:天津朝海科技有限公司