專利名稱：一種剪切dna的dna酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種催化活性DNA分子，它們能夠切割其他DNA序列。
背景技術：
已知的自然界存在的幾種具有催化活性的RNA。一類已經發現并對其做了四種不同的催化活性修飾，它們被命名為核酶錘頭狀(Symons，1992)、發卡(Symons，1992)、肝炎病韋(Wu, Lin et al. 1989)和脈抱菌核酶(Saville and Collins 1990)。在自然界，這些核酶可以催化單鏈翻轉、自身剪切等反應。在實驗室，這些核酶經過修飾處理(通過在不同的酶和底物中分離具有自身剪切的分子)發揮催化作用，例如一個酶可以翻轉底物(Fauzi, Kawakami et al. 1997), (Guo and Collinsl995), (Hegg and Fedor 1995)和 (Stage-Zimmermann and Uhlenbeck 1998).另一些核酶通過堿基互補配對識別底物。“錘頭”狀和“發卡”狀的核酶比較特別，經過修飾可以在特定的剪切位點剪切任意的RNA序列，這些核酶已經成功的運用與體內進行滅活目標RNA序列(Reviewed(Lustigand Jeang2001), (Sun, Cairns et al. 2000)，(Muotri, Pereira et al. 1999)).最近能夠剪切RNA的DNA酶(DNAenzyme or DNAzymes)已經得到，雖然沒有報道過自然界存在DNA酶，但是運用體外篩選(“SELEX”)(Tuerk and Gold 1990)的方法從含有隨機序列的文庫里分離得到了具有催化功能的DNA酶(Reviewed in (Breaker 1999)),包括能剪切RNA序列的DNA酶。這些DNAzymes在以RNA做為底物的反應中具有多種用途。(Breaker and Joyce 1994), (Breaker and Joyce 1995), (Faulhammerand Famulok1996), (FauIhammer and Famulok 1997), (Li, Zheng, etal. 2000), (Roth and Breaker1998), (Santoro and Joyce 1997) (Geyer and Senl997, 1998)。上述不同的 DNA 酶，都可以剪切在通過3’端磷酸ニ酯鍵連接單個核糖核苷酸欠在DNA序列中，已經報道的這些反應需要ニ價金屬離子，包括鉛離子(Breaker and Joyce 1994),猛離子(Breaker andJoycel995), I丐離子(Faulhammer and Famulok 1996)和鋒離子(Li, Zheng, etal. 2000)。還有一種DNA酶是需要組氨酸(Roth and Breaker 1998)。上述DNA酶只能特異性的剪切中間含有一個核糖核苷酸的DNA序列不能剪切全DNA序列的底物.Breaker篩選的能發生自身剪切的DNA酶(Breaker, 1996)和Silverman篩選出的依賴鋅離子和猛離子的10MD5 (Silverman and Sachdeva 2009)是僅有的兩例剪切DNA的DNA酶。
發明內容
本發明描述了ー種具有位點特異性內切核酸酶活性的DNA酶，這種活性針對預先選定的底物核酸序列中被定義為切割位點的脫氧核苷酸序列具有特異性。該DNA酶具有第一和第二兩個底物結合區域，位于核心區域的兩側，其中所述的第一底物結合區域有一段序列與預先選定的底物核酸序列的第一部分互補，而所述第二底物結合區域有一段序列與預先選定的底物核酸序列的第二部分互補，核心區域有一段選自下列通式所述序列的其中之一的序列(1.)CACTGT(SEQ ID NO 10)，TGT 莖，TC 環，TATTCCTGGATAA(SEQ ID N09)，其中 TGT莖部分通過堿基互補配對，TGT莖可以延長ー個堿基對，并且TGT莖上的堿基對可以替換只要符合堿基互補配對原則。SEQ ID NO 9中有五個突變位點之內的突變或缺失，SEQ ID NO10有三個突變位點之內的突變或缺失；TGT莖，TC環部分有60個堿基以內的插入或缺失屬于本發明的保護范圍。在一個優選實施例中，式I為SEQ ID NO 6 (A-2)。(II)CATCGTAGTGTCAGCCAT(SEQ ID NO 11)，CAT 莖，AT 環，其中 CAT 莖部分通過堿基互補配對或“擺動”配對，CAT莖可以延長也可以縮短為只有三個堿基對長度，AT環可以延長也可以縮短為三個堿基.SEQ ID NO 11中有五個之內位點突變或缺失；CAT莖，AT環有60個堿基以內的插入或缺失屬于本發明的保護范圍。在一個優選實施例中，式II為SEQID NO 7 (A-3)。
(III) TGGAT (SEQ ID NO 12)，GAT 莖，CA 環，CGGGTCC(SEQID NO 13)。其中 GAT 莖可以延伸或縮短，CA環也可以延伸或縮短，而且GAT莖和CA環部分可以去棹。SEQ ID NO12中有三個突變位點之內的突變或缺失，GAT莖，CA環有60個堿基以內的插入屬于本發明的保護范圍。在一個優選實施例中，式III為SEQ ID NO 8(F-8)。在ー個實施實例中，本發明的預先選定的底物核酸序列即剪切的底物可以是例如可以是如序列表SEQ ID NO 4所示的底物核酸序列。在一個實施實例中，本發明的DNA酶可以剪切底物的不同核苷酸位置，同一種DNA酶可以剪切不同序列的底物。本發明的DNA酶具有內切核酸酶活性，由此該內切活性需要ニ價陽離子的存在。在各種優選的替代實施方案中，該ニ價陽離子選自Mg2+，Cu2+或Mn2+。其中Cu2+或Mn2+可以使催化活性增強。在本發明的各種優選實施例中，DNA酶包括一段選自下列序列的核苷酸序列SEQID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 25，SEQ IDN026, SEQ ID N027, SEQ IDNO 28，SEQ ID N029, SEQ ID NO 30。如此處公開的一祥，為了生成多種其他有用的剪切DNA的DNA酶，可以采用多種取代、缺失、插入、復制和其它突變的方法來制備屬于公開范圍的分子，只要所述分子表現出了此處描述的位點特異性的剪切活性，那么它們就屬于本說明書的范圍之內。在一個優選方案中，第一底物結合區域優選包括一段選自下列序的核苷酸序列TGG, TGGA, TGGAT, TGGATC, TGGATCG, GTATGG, GTATGGA, GTATGGAT, GTATGGATCGGC(SEQ IDNO 22)，第二底物結合區域包括一段選自下列序列的核苷酸序列TTCC，GTTCC，TGTTCC，GTGTTCC, AGTGTTCC, GTTCCG, TGTTCCG,GTGTTCCG,AGTGTTCCG。在本發明各種實施方案，底物結合區域的長度是可以變化的。因此，例如，所述的第一和第二底物的結合區域可以包括2到多個核苷酸。然而，應該理解的是，底物結合區域長度約3-12個核苷酸，優選約5-9個這些底物的優選區域時經具體優選的。所述的第一和第二底物的結合區域包括一段與選自SEQ ID NO 13-SEQ ID NO 21的序列互補的核苷酸序列。在各種優選的實施方案中，本發明的DNA酶是全序列單鏈或部分單鏈。優選地，這些DNA酶可以假定為各種與它們的催化活性相吻合的形狀。因此，在一個變化中，本發明的DNA酶包括一個或多個發夾結構。在另ー個實施方案中，本發明的DNA酶表現出的剪切速率0. 0487^^0. 20681^,在加入H2O2后剪切速率明顯加快約為0. 17min^^0.如圖12所示。本發明描述的DNA酶是通過體外篩選的方式得到的。體外篩選是ー個從大量不同的序列中通過多輪篩選和擴增得到具有特殊功能DNA或RNA分子的方法。(Joyce, 1994; Chapman et al. , 1994),體外篩選的方法已經用于得到大量的核酶,這些核酶有的具有新的催化活性有的可以識別寡核苷酸，(例如，適體)。體外篩選的一種實施例，從篩選一段序列開始，如一段目標序列——即希望能被構建的具有催化活性DNA分子切割的序列。通過把預先選定的目標序列的兩端通過堿基互補配對原則與具有催化活性的DNA分子邦定在一起，從而形成一定數目的能在特定位點切 割底物的核酸序列的DNA分子。上述構建的催化活性DNA分子的中間隨機序列為40個脫氧核苷酸。長約廣80個脫氧核苷酸的隨機序列也是在本發明所期望的范圍之內。在各種實施方案中，本發明的DNA酶分子中可能結合有包括添加，缺失或取代在內的ー種突變。在替代的技術中，可以用產生隨機或特異突變的方法來產生這些突變。在各種優選的實施方案中，本發明的脫氧核酶包括不超過200個核苷酸。在本發明的一個實施方案中，用于產生具有催化活性DNA分子的序列選自SEQ IDNO 3，所選用的底物序列選自SEQ ID NO 4。術語定義脫氧核酶脫氧核酶是利用體外分子進化技術合成的ー種具有催化功能的單鏈DNA片段，具有高效的催化活性和結構識別能力。此處能夠和脫氧核酶互換使用的其他詞匯是“催化活性DNA分子”，“DNAzyme "，無論這些分子是通過合成制備的或是來自有機體或其它來源，它們都應該被理解為包括其酶促活性部分。內切脫氧核糖核酸酶指一種能切割主要由DNA組成的底物的酶。互補核苷酸序列指DNA或RNA的單鏈分子或節段中的一段核苷酸序列與另一條寡核苷酸單鏈的序列充分地互補從而通過氫鍵特異性地雜合在一起。“ SELEX，，！systematic evolution of ligands byexponentialenrichment, selex.利用該技術可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與革巴物質高度親和的核酸適體(Aptamer)。自Tuerk等首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4 DNA聚合酶和有機染料分子的特異嘎核苷酸配基后，經過十年的發展，SELEX技術已經成為ー種重要的研究手段和工具。
圖1是用于篩選能夠切割目標DNA的催化活性DNA分子的方案；如圖1所示，將人工合成的中間含有40個核苷酸序列的文庫，通過PNK在5'端進行磷酸化，然后與底物連接形成分子內形式。在篩選Buffer里25度12小時篩選，在PAGE膠上分離出具有活性序列的DNA分子，回收進行PCR擴增，通過PAGE膠分離出含有活性DNA分子序列，進行下輪篩選。圖2是篩選過程中在多種金屬離子作用下每輪的剪切百分率；DNA起始庫(Rl)以及第2輪到第10輪(R2 R10)具有催化活性的DNA分子對底物的剪切百分率。圖3是原始篩選具有催化活性DNA分子的結構圖；該圖給出的是起始文庫的示范分子，該分子表現出了 SEQ ID NO 3代表的分子總體構象。如圖所示，各種互補核酸位于隨機序列(MO)兩旁。圖4是經篩選得到的其中一個催化活性DNA分子的ニ級結構圖；該圖顯示的是ー個通過此處公開的方法產生的具有催化活性的DNA分子與底物結合形成的簡單復合分子。圖5是經過篩選出的ー個序列為SEQ ID NO 8所示的具有催化活性的DNA分子(F-8)對金屬離子依賴性·
其中空白是不加具有催化活性DNA分子的，樣品指進行篩選所用的反應液，其中含有Na+，K+，Mg2+，Cu2+，Mn2+等金屬離子，在后面的反應中分別在原來的Buffer中減去這些離子，從PAGE膠上可以看出減去Cu2+，或Mn2+以后只有10%左右的剪切，減去Na+，K+，Mg2+仍然有65%的剪切，所以該催化活性DNA分子剪切DNA序列的底物是依賴Cu2+，Mn2+離子。圖6，圖7，圖8是基本按照下面實施例1中描述的方法進行10輪體外篩選克隆測序得到的三條DNA酶與底物形成的ニ級結構圖。其中，圖6為A-2DNA酶與底物形成的ニ級結構；圖7為A-3DNA酶與底物形成的ニ級結構；圖8為F-8DNA酶與底物形成的ニ級結構圖。如圖6，圖 7，圖 8 所示,所示為序列 SEQ ID NO 21 (5’ -CCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACACT-3’)所示的底物序列與DNAzyme分離(即給出的是分子間切割)，三圖均有兩個位點表現出DNA酶對目標序列最有效的切割。剪切位置為剪刀所示的位置。其中圖6所示序列SEQ ID NO 6的DNA酶(A-2)和圖7所示序列SEQ ID N07的DNA酶(A-3)在堿基上進行剪切，圖8所示序列如SEQ ID NO 8所示DNA酶(F-8)在磷酸鍵上進行斷裂。切割條件在篩選反應液中，PH 7. 4，25°C，12小時后收集數據得出的。其中A-2的剪切速率為0. 206811'A-3的剪切速率為0. 21791T1，F-8的剪切速率為0. 1373h'豎線(|)表示的是互補配對。圖9，圖10，圖11分別是具有催化活性的序列如SEQ ID NO 6所示的DNA分子(A-2)、序列如SEQ ID NO 7所示的DNA分子(A-3)和序列如SEQ ID NO 8所示的DNA分子(F-8)與底物的組成簡圖；通過非特異的互補核苷酸(水平線)之間的互補性的Watson-Crick堿基對，DNA酶(下面的鏈)和DNA底物(上面的鏈)結合起來，其中底物中間標出的堿基有的位置是可變，N=A, T、G 或 C ;W=T、C 或 A ；Y=T 或 C。圖12為F-8⑴在加入50 ii M H2O2測定的剪切速率；該圖中上面為PAGE膠上的剪切情況，反應時間分別為0，5，10，15，20，30，40分鐘，Kobs 是通過 PraphPad software Prism 4. 0 計算出來的。
具體實施例方式以下結合實施例詳細地說明本發明。實施例是為了便于更好的理解本發明，但并非對本發明的限制。實施例1體外篩選能夠剪切DNA的DNA酶。首先合成一個含約IO12個單鏈DNA分子的初始文庫，其中在5’端有一段固定序列能與底物DNA的第一結合區域邦定在一起，3’端有一段固定序列能與底物第二結合區域邦定在一起，中間為由40個堿基的隨即序列組成的強催化結構區域，在合成時即每個隨即位置出現A，T，C，G的概率相同。DNA文庫LB (如圖1SEQ ID NO 3)。取InM通過T4PNK酶在DNA分子的5’端進行磷酸化，通過T4連接酶將文庫DNA分子LB與底物LS (SEQ ID NO 4)通過夾板T (SEQ IDNO 5)連接起來，在篩選反應液(50mM HEPES, 400mM NaCl, IOOmM KCl, IOmM MgCl2, 7. 5mMMnCl2, 50 u M CuCl2) 25°C條件下溫育12小時，通過跑10%的PAGE膠將具有催化活性能剪切目標底物的DNA分子的區域切割回收，在引物Pl (SEQ ID NO I)和引物RPl (SEQ ID NO 2)下進行PCR擴增，其中與引物Pl相比引物RPl是經過PEG修飾在5’端多多出20個堿基，PEG具有阻止鏈繼續擴增的功能，這樣由RPl擴增出的鏈比我們要的具有催化活性的DNA鏈要長，根據擴增出的兩條鏈長度不同，在PAGE膠 上分離出短的鏈(如圖1)回收并進行PNK用于下ー輪的篩選。其中100 U I的PCR反應液中包含IOOpmol的Pl，和IOOpmol的RPl的序列如下LB A GCT TGT ACT AGT GTT CC NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN N TGG ATC GGC ATG ACTAACPlAGC TTG TAC TAG TGT TCCRPlAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-PEG-GTT AGT CATGCC GAT CCA(2)反應體系及PCR條件
Pl100 pmol
RPlOOpmoi
Taq 酶5 U
dNTPs0.4 mM
LB0—200 pmol
10倍Taq緩沖液 IOlLd 超純水將體系補足到100 [il。PCR 條件是95°C預熱 Imin ;95°C變性 30s，49°C復性 45s，72°C延伸 45s，28 個循環。做了 10輪篩選，從第7輪出現剪切條帶，在第10輪做了克隆。用TA克隆試劑盒。測序找出具有活性的DNA序列，通過合成出的活性DNA驗證找出三條活性比較強的序列，A_2，A_3, F_8 o實施例2催化活性DNAs的動力學分析用5’-32P標記的底物與IOOpm的催化活性DNA在篩選反應液組成的混合液10 U I在25°C下分別在0. 5,1,1. 5，2，4，6，8，10，12，14小時的時候加入10111 EDTA(pH 8. 5)停止反應，通過10%的PAGE膠分離切割產物,將切割的百分率通過PraphPad software Prism4.0.軟件得到每條DNAzyme的切割速率。如圖12為加入H2O2后F_8 (X)的剪切速率圖。實施例3本發明進一歩提供了核酸剪切包括ー種約5. 5-8. 5的pH值，一種優選方案中，pH值范圍約為6. 5-8. 5，在pH 8. 5時剪切速度最快，在實驗中我們在pH 7. 4時分析的。本領域技術人員可以理解，只要用于核酸剪切的pH能使DNA酶保持活性構型，本發明的方法可以在ー個寬的PH范圍實施。核酸剪切的條件還包括ー個溫度的變化。在一個實施方案中溫度范圍為約150C -60°C，在實驗中我們優選25°C做為剪切溫度。與核酸剪切的條件一致的溫度范圍只 受期望的剪切速度和該具體溫度下該種DNA酶的穩定性限制。
權利要求
1.一種具有位點特異性內切核酸酶活性的DNA酶，其特征在于，該DNA酶具有第一和第二兩個底物結合區域，位于核心區域的兩側，其中所述的第一底物結合區域有一段序列與預先選定的底物核酸序列的第一部分互補，而所述第二底物結合區域有一段序列與預先選定的底物核酸序列的第二部分互補，核心區域有一段選自下列通式所述序列的其中之一的序列(1.) CACTGT (SEQ ID NO 10)，TGT 莖，TC 環，TATTCCTGGATAA (SEQ ID NO 9)，其中 TGT 莖部分通過堿基互補配對，TGT莖可以延長一個堿基對，并且TGT莖上的堿基對可以替換只要符合堿基互補配對原則； (II)CATCGTAGTGTCAGCCAT (SEQ ID NO 11)，CAT 莖，AT 環，其中 CAT 莖部分通過堿基互補配對或“擺動”配對，CAT莖可以延長也可以縮短為只有三個堿基對長度，AT環可以延長也可以縮短為三個堿基；(III)TGGAT (SEQ ID NO 12)，GAT 莖，CA 環，CGGGTCC (SEQID NO 13)，其中 GAT 莖可以延伸或縮短，CA環也可以延伸或縮短，而且GAT莖和CA環部分可以去掉。
2.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，中的分子，其中所述的通式I為如SEQID NO 6所述的序列。
3.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式I中SEQID NO 9中可以有五個突變位點之內的突變或缺失，SEQ ID NOlO可以有三個突變位點之內的突變或缺失；或者，TGT莖、TC環部分可以有60個堿基以內的插入或缺失。
4.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式II為如SEQID NO 7所述的序列。
5.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式II中SEQID NO 11中可以有五個之內位點突變或缺失；或者，CAT莖、AT環可以有60個堿基以內的插入或缺失。
6.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式III為如SEQID NO 8所述的序列。
7.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式III中SEQID NO 12中可以有三個突變位點之內的突變或缺失；或者，GAT莖、CA環可以有60個堿基以內的插入。
8.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的第一或第二底物結合區域的長度為3 12個核苷酸；優選包括一段與選自如SEQID NO 13 SEQ ID NO 21的序列互補的核苷酸序列。
9.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述DNA酶的內切核酸酶活性因二價陽離子的存在而增強；其中二價陽離子優選為Mg2+，Cu2+或Mn2+，其中Cu2+或Mn2+可以使所述DNA酶的催化活性增強。
10.根據權利要求1所述的DNA酶，其特征在于，所述的DNA酶的剪切速率(K.)為O.0487h-^0. 2068^1 ;所述的DNA酶的催化活性可以因氧化劑H2O2的加入催化活性增強。
全文摘要
本發明涉及一種具有位點特異性內切核酸酶活性的催化活性DNA分子，該DNA分子能夠切割其他DNA序列。該DNA分子具有第一和第二兩個底物結合區域，位于核心區域的兩側，其中所述的第一底物結合區域有一段序列與上述預先選定的底物核酸序列的第一部分互補，而所述第二底物結合區域有一段序列與上述預先選定的底物核酸序列的第二部分互補，核心區域有一段根據權利要求1所述通式的序列。
文檔編號C12N9/22GK103013953SQ201210399318
公開日2013年4月3日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者唐卓, 張華帆 申請人:中國科學院成都生物研究所