專利名稱：柑橘木虱特異性分子標記dna序列及其鑒別引物和鑒別方法
技術領域：
本發明屬于生物化學與分子生物學領域，具體涉及柑橘木虱特異性分子標記DNA序列及其鑒別引物和鑒別方法。
背景技術：
柑橘木風(D iaphorina citri Kuwayama)屬同翅目木風科,是柑橘黃龍病亞洲種和美洲種唯一的傳播媒介。它取食黃龍病株后可終生帶毒，且傳毒率高。目前我國防治柑橘木虱主要采取砍樹和化學防治兩種措施。化學防治柑橘木虱雖然有一定的效果，但頻繁的使用農藥對生態環境破壞和產生嚴重的抗藥性問題不容忽視。因此尋找新的防控方法與途徑是一項迫切的任務。節肢動物捕食者被認為是控制害蟲種群增長的重要因素之一。對可持續控制柑橘園害蟲具有重要意義。然而，目前對捕食性天敵田間捕食柑橘木虱的定量評價還缺乏行之有效的方法，如何利用分子生物學技術定性與精確定量檢測捕食性天敵對柑橘木虱捕食效能，準確分析柑橘木虱捕食性天敵譜將成為害蟲防治技術突破的關鍵。
發明內容
本發明的第一個目的是提供從柑橘木虱基因序列中克隆的，能用于柑橘木虱的物種鑒別和柑橘木虱捕食性天敵譜的檢測的柑橘木虱特異性DNA分子標記。本發明通過設計特異性引物并進行PCR擴增，大量篩選柑橘木虱CO I分子標記， 獲得420bp的DNA條帶，經對其克隆、測序和同源比較，明確該條帶可作為特異性分子標記，用于柑橘木虱的鑒別和捕食性天敵對柑橘木虱的捕食效能評價，從而實現了本發明的目的。本發明的柑橘木虱特異性DNA分子標記，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。本發明的第二個目的是提供一對能特異性鑒別柑橘木虱的PCR引物，其特征在于，包括上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC (SEQ ID NO. 2所示)和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA (SEQ ID NO. 3 所示)。本發明的第三個目的是提供一種能特異性鑒別柑橘木虱的試劑盒，包括PCR反應試劑和引物，其特征在于，所述的引物為上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA。用此引物擴增田間采集的害蟲和天敵各物種基因組DNA樣本，如有420bp擴增條帶的為含有柑橘木虱物種的樣本。因此本發明的第四個目的是提供一種鑒別柑橘木虱的方法，其特征在于，以上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC 和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA 作為引物，通過 PCR的方法擴增DNA樣本，如有420bp擴增條帶的則為含有柑橘木虱物種的樣本。本發明克服了傳統的研究捕食性天敵對害蟲捕食效應的觀察法和生化手段研究捕食者與獵物關系的程序的復雜性、費用高、缺乏對靶標的特異性等問題，提供了對柑橘木虱快速、準確、特異性鑒定的柑橘木虱特異性分子標記DNA序列及其鑒別引物和鑒別方法，為昆蟲捕食行為研究提供有效的方法。
圖I為用設計的鑒別引物對21個物種DNA樣本進行PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。M DNAMarker ；1 :陰性對照水；2 :柑橘木風若蟲nymph of Diaphorina citri ；3 陽性對照(喂食2頭柑橘木風若蟲的龜紋瓢蟲)Positive control Propylea japonica ；4 龜紋瓢蟲 Propylea japonica ；5 日本刀角瓢蟲 Serangium japonicum ；6 :紅肩瓢蟲 Leisimidiate ；7 :小瓢蟲亞屬 Scymnus pullus(sp) ；8 :麗草蛉幼蟲 Chrysopa sinica ；9 :八斑球腹蛛 Theridion octomaculatum ； 10 :大銀腹蛛 Leucauge magnifica ；11 :草間小黑蛛 Erigonidium graminicolum ; 12 :斜紋貓蛛 Oxyopes sertatus ; 13 :微蟹蛛屬 Lysiteles (sp)； 14 :黑細長蟻 Teraponera nigar ；15 :舉腹蟻屬 Crematogaster (sp) ； 16 牙蟲 Aphidoideasp ；17 :柑橘黑刺粉風Aleurocanthus spiniferus ； 18 :紅蜘蛛Tetranychus cinnbarinus ；19 :卷葉蛾 Homona magnanima ；20 :稻幢屬 Oxya(sp) ；21 :紅脊長疇 Tropidothoraxelegans ；22 :柑橘潛葉蛾 Phyllocnistis citrella ；23 :蟲堂螂科 Mantidae (sp)。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :柑橘木虱特異性DNA分子標記序列的獲得及應用采用單頭勻漿法提取各物種基因組DNA參考安瑞生等(安瑞生，譚聲江，陳曉峰.小型昆蟲DNA提取時勻漿方法的改進.昆蟲知識，2002，39 (4) :311-312)的方法，將單頭蟲用雙蒸水清洗、吸干裝入I. 5mL離心管，加入 50μ L 提取緩沖液 A [1%SDS, 50mmol/LTris · Cl, 25mmol/LNaCl, 25mmol/LEDTA]，-20°C放置5min后以研磨棒搗碎，然后用100 μ L提取緩沖液沖洗研磨棒；65°C水浴45min，中間取出混勻2次；加入等體積的提取液B [3mol/L KAc (pH7. 2)]，冰上放置Ih以上；12000r/min離心IOmin,移上清液于另一離心管中12000r/min離心IOmin,加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，放置_20°C Ih以上；12000r/min，離心lOmin，收集沉淀，用70%乙醇洗滌f 2次；晾干沉淀；每管加入50 μ LO. ΙχΤΕ，充分溶解后_20°C保存備用，即得到基因組DNA。采用PCR擴增技術，進行柑橘木虱特異性分子標記DNA序列的篩選針對柑橘木虱的COI基因設計特異性引物序列上游引物序列TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC(如 SEQ ID NO. 2 所示)；下游引物序列TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA(如 SEQ ID NO. 3 所示)。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，并用于本實驗所有供試物種DNA的擴
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>曰οPCR 反應體系為 25 μ L Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L ； ΝΤΡ2μ L ；10Xbuffer2. 5 μ L ；上游引物IuL;下游引物luL;DNA模板luL;ddH2017uL。PCR擴增反應在EppendorfMastercyclerep基因擴增儀中進行,對照反應體系中的DNA模板以雙蒸水代替。擴增程序為94°C預變性5min ;然后94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，擴增35個循環；最后72°C延伸5min，得到PCR擴增產物。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠分離，電泳緩沖液為O. 5 X TBE,取PCR擴增產物IOyL與IyL上樣緩沖液混合點 入膠孔。標準分子量為2000bp DNA Ladder (Takara提供)，100V恒壓電流30min，凝膠成像系統觀察拍照。樣品I :將柑橘園采回來的，與柑橘木虱同域發生的節肢動物龜紋瓢蟲Propylea japonica ;曰本刀角票瓜蟲 Serangium japonicum ;紅肩票瓜蟲 Leis imidiate;/J、瓢蟲亞屬Scymnus pullus(sp);麗草蛉幼蟲Chrysopa sinica ;八斑球腹蛛Theridionoctomaculatum ;大銀腹蛛 Leucauge magnifica ;草間小黑蛛 Erigonidium graminicolum ；斜紋貓蛛 Oxyopes sertatus ;微蟹蛛屬 Lysiteles (sp);黑細長蟻 Teraponeranigar ;舉腹蟻屬 Crematogaster (sp) ； Φ牙蟲 Aphidoidea sp ;柑橘黑刺粉風 Aleurocanthusspiniferus ;紅蜘蛛 Tetranychus cinnbarinus ;卷葉蛾 Homona magnanima ;稻蟲皇屬Oxya(sp);紅脊長疇 Tropidothorax elegans ;柑橘潛葉蛾 Phyllocnistis citrella ；螳螂科Mantidae (sp)，饑餓48h后，然后再按照上述方法提取DNA，用上游引物序列TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC，下游引物序列TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA 按照上述 PCR 方法進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行電泳分析。以取食2頭柑橘木虱若蟲的龜紋瓢蟲成蟲作為陽性對照、清水作為陰性對照，檢驗COI引物(特異性引物)的種特異性，以避免在使用柑橘木虱特異性引物的PCR中出現假陽性，PCR反應體系與程序同上。電泳結果如圖I所示，從圖I中可以看出，只有柑橘木虱若蟲和陽性對照(喂食2頭柑橘木虱若蟲的龜紋瓢蟲)能夠檢測到420bp的特異性條帶(對其進行測序，其序列如SEQ IDN0. I所示)，而其他同域發生的節肢動物不能檢測到該特異性條帶，由此可見，本發明的特異性引物特異性強，能專一的檢測出柑橘木虱，而與同域發生的其他節肢動物不發生反應，因此可以快速專一的檢測出柑橘木虱。樣品2 :以柑橘園新鮮采回來的各種捕食性天敵為對象，應用特異性引物上游引物序列TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC，下游引物序列TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA 按照上述 PCR方法進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行電泳分析，以檢測各種捕食性天敵對對柑橘木虱的捕食作用的陽性反應率，如果能檢測到420bp的特異性條帶，則說明是陽性。檢測的捕食性天敵的種類和結果如表I所示，從表I可以看出，在所檢測的8類群20種捕食性天敵中，瓢蟲、草蛉、食蚜蠅、獵蝽、螞蟻等天敵均具有捕食柑橘木虱的能力，其中以龜紋瓢蟲Propyleajaponica、斜紋貓蛛 Oxyopes sertatus、_草嶺 Chrysopa formosa 最為明顯。因此，該420bp的特異性DNA序列可作為捕食性天敵捕食柑橘木虱的分子標記。表I :田間捕食性天敵對柑橘木虱捕食作用的COI檢測。
權利要求
1.一種柑橘木虱特異性DNA分子標記，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示 ο
2.一對能特異性鑒別柑橘木虱的PCR引物，其特征在于，包括上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC 和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA。
3.一種能特異性鑒別柑橘木虱的試劑盒，包括PCR反應試劑和引物，其特征在于，所述的引物為上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC 和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA。
4.一種鑒別柑橘木虱的方法，其特征在于，以上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA作為引物，通過PCR的方法擴增DNA樣本，如有420bp擴增條帶的則為含有柑橘木虱物種的樣本。
全文摘要
本發明公開了一種柑橘木虱特異性分子標記DNA序列及其鑒別引物和鑒別方法。該柑橘木虱特異性分子標記DNA序列如SEQ ID NO.1所示，其鑒別引物如SEQ ID NO.2和3所示。本發明克服了傳統的研究捕食性天敵對害蟲捕食效應的觀察法和生化手段研究捕食者與獵物關系的程序的復雜性、費用高、缺乏對靶標的特異性等問題，提供了對柑橘木虱快速、準確、特異性鑒定的柑橘木虱特異性分子標記DNA序列及其鑒別引物和鑒別方法，為昆蟲捕食行為研究提供有效的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102876669SQ20121039815
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者孟翔, 歐陽革成, 郭明昉, 方小端, 盧慧林 申請人:廣東省昆蟲研究所