一種bdna在尿液中檢測pca3的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供的一種BDNA在尿液中檢測PCA3的應用(1)PCA3標本搜集；(2)研究PCA3標本搜集；(3)利用BDNA技術檢測：本發明利用bDNA技術擅長對小片段基因的捕獲，獨特設計的目標探針與PCA3高效特異結合，加上改進的放大信號體系使得靈敏度、特異性均有保證。該技術避免了傳統PCR的假陽性、假陰性問題，且操作簡單，凡具有分子生物學實驗基本技能人員均可操作。同時，本技術檢測的結果靈敏度高、陽性檢出率高、穩定性和可重復性好、操作簡便、省時、易于普及。
【專利說明】—種BDNA在尿液中檢測PCA3的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及前列腺癌檢測領域，尤其涉及一種BDNA在尿液中檢測PCA3的應用。【背景技術】
[0002]目前，前列腺癌早期診斷方法及PCA3優勢前列腺癌(PCa)是西方國家男性最常見惡性腫瘤，位于死亡原因第二位。隨著我國人口老齡化、飲食結構西方化以及診斷技術的提高，PCa的發病率和診斷率逐年增加。
[0003]診斷前列腺癌最常用的標記物是PSA，但PSA是前列腺組織特異性抗原，不是PCa特異性抗原，故良性前列腺增生、前列腺炎、急性尿潴留、前列腺的各種手術操作和檢查均可引起血清PSA高，疾病特異性差。美國每4個血清PSA > 4ng/ml的老年男性中僅I人被穿刺活檢證實為前列腺癌。還有約15%的PCa患者血清PSA小于4ng/mL。臨床迫切需要一種腫瘤特異性標記物來診斷前列腺癌。而PCA3基因是PCa特異性基因，因此使用PCA3基因作為診斷PCa的腫瘤標記物將比PSA有更好的敏感性及特異性。
[0004]PCA3定位于第9號染色體(9q21_22)，全長約25kb，包含3個內含子和4個外顯子。研究表明PCA3是一種非編碼RNA基因，其蛋白產物非常少，因此對PCA3的mRNA檢測更具針對性。
[0005]PCA3自從1999年首次被發現后經過了漫長的研究，目前國外對PCA3預測前列腺癌的敏感性和特異性是肯定的，它優于PSA。PCA3在前列腺癌組織中的特異性高表達使其成為一個前景廣闊的前列腺癌標志物。但對PCA3高表達的機制、其生物學功能及PCA3在前列腺癌形成和疾病進展的關鍵生化途徑中有`何意義等方面仍存在許多未知的、需要探索的領域。在腫瘤診斷方面因為PCA3轉錄產物僅僅為十幾kb的片段，而mRNA在一般環境和運輸保存中容易降解，因此采用哪一種技術平臺來檢測PCA3是確保診斷準確可靠的關鍵。目前國外檢測PCA3主要有三種方式，PCR技術、TMA技術、和bDNA技術。前兩種技術最大不確定性是核酸序列擴增帶來的固有的假陽性和假陰性問題。因為該技術的放大是用引物擴增，需要擴增的區域是完整的，如標本中的RNA斷裂和降解或變異就無法與引物結合，導致假陰性。bDNA技術(branched DNA, bDNA)是目前唯一被美國FDA批準用于艾滋病毒(HIV)和丙肝病毒(HCV)檢測的最新技術，bDNA技術中使用的探針包括目標探針(targetprobe)、前放大體(preamplifier)、放大體(amplifier)、標記探針(label probe)。上述探針中只有目標探針需要針對不同的目的基因進行不同設計，后三種探針對任何基因的bDNA分析都是通用的。目標探針包含了多種針對PCA3基因不同片段的特異性探針，用于捕捉目標基因片段。放大探針是技術的關鍵。
【發明內容】
[0006]本發明的目的為解決以上技術問題，提供一種靈敏度高、陽性檢出率高、穩定性和可重復性好、操作簡便、省時、易于普及的在尿液中檢測PCA3的應用。
[0007]為了解決上述技術問題，本發明提供的BDNA在尿液中檢測PCA3的應用是這樣實現的:
[0008]一種BDNA在尿液中檢測PCA3的應用，所采用的操作步驟為:
(1)PCA3標本搜集
尿液PCA3檢測使用標本為經直腸前列腺按摩后的尿液標本:
1)檢查前飲水500ml有助于收集尿液標本；
2)前列腺指檢后立即搜集尿液；
3)至少要20-30ml尿液，收集在貼好標簽的杯子里，必須是最初排泄的尿液標本，保存尿液的尿杯里不應含任何防腐劑；
4)如果標本長期保存，應放_80°C，短期內檢測放置_20°C保存。
(2)研究PCA3標本搜集
1)研究利用PCA3作為靶標在前列腺癌診斷個體化評估中的可行性；
2)研究bDNA技術平臺檢測經直腸前列腺按摩后尿液中PCA3評分診斷前列腺癌的靈敏度、特異性、檢測速度，以及是否便于通量檢測；
3)研究不同臨床分期和病理分級的前列腺癌患者PCA3評分變化是否有統計學差異和臨床意義；
4)研究PCA3評分，作為前 列腺癌進展及預后評判指標和前列腺癌治療后監測指標的可行性；
5)研究中國人PCA3的ROC曲線以及評分標準和診斷閾值；
6)研究PCA3異構體在中國前列腺癌患者人群的表達以及在不同病理分級的腫瘤標本中是否有差異表達；
7)研究PCA3不同異構體表達下，雄激素受體異構體表達情況，分析兩者是否有相關性。
(3)利用BDNA技術檢測:
1)建立用bDNA技術檢測尿液中PCA3早期診斷前列腺癌的最佳檢測流程；
2)建立中國人PCA3評分的ROC曲線和PCA3診斷閾值，以及PCA3對前列腺癌個體化診斷中的評估體系；并將PCA3作為無創性診斷前列腺癌的標志物在臨床推廣應用；
3)了解中國前列腺癌患者PCA3異構體表達特異性；
4)了解中國前列腺癌患者PCA3異構體表達與雄激素受體異構體表達的相關性。
5)bDNA技術中使用的探針包括目標探針(target probe)、前放大體(preamplifier)、放大體(amplifier)、標記探針(label probe),上述探針中只有目標探針需要針對不同的目的基因進行不同設計，后三種探針對任何基因的bDNA分析都是通用的，目標探針包含了多種針對PCA3基因不同片段的特異性探針，用于捕捉目標基因片段，以便得出更準確的結果O
[0009]本發明的有益效果是，利用bDNA技術擅長對小片段基因的捕獲，獨特設計的目標探針與PCA3高效特異結合，加上改進的放大信號體系使得靈敏度、特異性均有保證。該技術避免了傳統PCR的假陽性、假陰性問題，且操作簡單，凡具有分子生物學實驗基本技能人員均可操作。同時，本技術檢測的結果靈敏度高、陽性檢出率高、穩定性和可重復性好、操作簡便、省時、易于普及。【具體實施方式】
[0010]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0011 ] 一種BDNA在尿液中檢測PCA3的應用，所采用的操作步驟為:
(1)PCA3標本搜集
尿液PCA3檢測使用標本為經直腸前列腺按摩后的尿液標本:
1)檢查前飲水500ml有助于收集尿液標本；
2)前列腺指檢后立即搜集尿液；
3)至少要20-30ml尿液，收集在貼好標簽的杯子里，必須是最初排泄的尿液標本，保存尿液的尿杯里不應含任何防腐劑；
4)如果標本長期保存，應放_80°C，短期內檢測放置_20°C保存。
(2)研究PCA3標本搜集
1)研究利用PCA3作為靶標在前列腺癌診斷個體化評估中的可行性；
2)研究bDNA技術平臺檢測經直腸前列腺按摩后尿液中PCA3評分診斷前列腺癌的靈敏度、特異性、檢測速度，以及是否便于通量檢測；
3)研究不同臨床分期和病理 分級的前列腺癌患者PCA3評分變化是否有統計學差異和臨床意義；
4)研究PCA3評分，作為前列腺癌進展及預后評判指標和前列腺癌治療后監測指標的可行性；
5)研究中國人PCA3的ROC曲線以及評分標準和診斷閾值；
6)研究PCA3異構體在中國前列腺癌患者人群的表達以及在不同病理分級的腫瘤標本中是否有差異表達；
7)研究PCA3不同異構體表達下，雄激素受體異構體表達情況，分析兩者是否有相關性。
(3)利用BDNA技術檢測:
1)建立用bDNA技術檢測尿液中PCA3早期診斷前列腺癌的最佳檢測流程；
2)建立中國人PCA3評分的ROC曲線和PCA3診斷閾值，以及PCA3對前列腺癌個體化診斷中的評估體系；并將PCA3作為無創性診斷前列腺癌的標志物在臨床推廣應用；
3)了解中國前列腺癌患者PCA3異構體表達特異性；
4)了解中國前列腺癌患者PCA3異構體表達與雄激素受體異構體表達的相關性。
5)bDNA技術中使用的探針包括目標探針(target probe)、前放大體(preamplifier)、放大體(amplifier)、標記探針(label probe),上述探針中只有目標探針需要針對不同的目的基因進行不同設計，后三種探針對任何基因的bDNA分析都是通用的，目標探針包含了多種針對PCA3基因不同片段的特異性探針，用于捕捉目標基因片段，以便得出更準確的結果O
[0012]得出的實驗數據:PCA3探針設計初步驗證 PCA3探針數據分析，一致性初步檢驗，32標本
【權利要求】
1.一種BDNA在尿液中檢測PCA3的應用，其特征在于，所采用的操作步驟為: (1)PCA3標本搜集 尿液PCA3檢測使用標本為經直腸前列腺按摩后的尿液標本: 1)檢查前飲水500ml有助于收集尿液標本； 2)前列腺指檢后立即搜集尿液； 3)至少要20-30ml尿液，收集在貼好標簽的杯子里，必須是最初排泄的尿液標本，保存尿液的尿杯里不應含任何防腐劑； 4)如果標本長期保存，應放_80°C，短期內檢測放置_20°C保存。 (2)研究PCA3標本搜集 1)研究利用PCA3作為靶標在前列腺癌診斷個體化評估中的可行性； 2)研究bDNA技術平臺檢測經直腸前列腺按摩后尿液中PCA3評分診斷前列腺癌的靈敏度、特異性、檢測速度，以及是否便于通量檢測； 3)研究不同臨床分期和病理分級的前列腺癌患者PCA3評分變化是否有統計學差異和臨床意義； 4)研究PCA3評分，作為前列腺癌進展及預后評判指標和前列腺癌治療后監測指標的可行性； 5)研究中國人PCA3的ROC曲線以及評分標準和診斷閾值； 6)研究PCA3異構體在中國前列腺癌患者人群的表達以及在不同病理分級的腫瘤標本中是否有差異表達； 7)研究PCA3不同異構體表達下，雄激素受體異構體表達情況，分析兩者是否有相關性。 (3)利用BDNA技術檢測: 1)建立用bDNA技術檢測尿液中PCA3早期診斷前列腺癌的最佳檢測流程； 2)建立中國人PCA3評分的ROC曲線和PCA3診斷閾值，以及PCA3對前列腺癌個體化診斷中的評估體系；并將PCA3作為無創性診斷前列腺癌的標志物在臨床推廣應用； 3)了解中國前列腺癌患者PCA3異構體表達特異性； 4)了解中國前列腺癌患者PCA3異構體表達與雄激素受體異構體表達的相關性。 5)bDNA技術中使用的探針包括目標探針(target probe)、前放大體(preamplifier)、放大體(amplifier)、標記探針(label probe),上述探針中只有目標探針需要針對不同的目的基因進行不同設計，后三種探針對任何基因的bDNA分析都是通用的，目標探針包含了多種針對PCA3基因不同片段的特異性探針，用于捕捉目標基因片段，以便得出更準確的結果O
【文檔編號】C12Q1/68GK103436594SQ201210391488
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年10月16日 優先權日:2012年10月16日
【發明者】張鷺鷺, 張愛國, 劉桐宇 申請人:科蒂亞(新鄉)生物技術有限公司