專利名稱：一種快速高效檢測亞硫酸鹽處理后dna甲基化修飾的pcr方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，尤其涉及表觀遺傳學修飾中DNA甲基化修飾方式的檢測手段。
背景技術：
DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因組最常見的一種DNA共價修飾形式，是表觀遺傳學的一個重要方面。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鳥嘌呤(7_mG)。真核生物中，DNA甲基化主要是以5-甲基胞嘧啶的形式存在。由于DNA甲基化特別是胞嘧啶甲基化在真核生物基因組中十分普遍，故受到生命科學界的極大關注。大量研究表明，DNA甲基化參與了高等生物的多種細胞活動。這其中主要包括組織特異性基因的表達，異染色質的形成，發育機制，轉座子的轉 座激活，X染色體的失活，基因組印記和腫瘤基因的形成等。DNA甲基化還能引起染色體結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質互作方式的改變，從而控制基因表達。因此，對于真核生物(特別是人類和植物)的甲基化修飾作用與基因“時”，“空”表達調控之間的關系；是分子生物學中非常熱點的研究之一。然而如何利用快速簡易的方法檢測出甲基化的修飾位點是一棘手問題，目前應用的比較廣泛的方法是亞硫酸鹽測序法(bisulfite sequencing),該方法理論上可以檢測出DNA序列中所有胞嘧啶的甲基化情況，該方法主要包括三個步驟亞硫酸鹽處理，PCR擴增目的片段，測序。雖然亞硫酸鹽處理和后續的測序技術均已有成型技術(亞硫酸鹽處理已有試劑盒商品，測序技術有測序公司)，但是PCR擴增目的片段的擴增是需要研究者自己操作完成的，因此在這一步驟中尚存在的問題是
(1)由于亞硫酸鹽處理后DNA序列會發生改變，且形成的胸腺嘧啶T容易形成發卡結構，一般的退火溫度無法完全打開雙鏈，為PCR擴增帶來困難，需要設計很多備選引物，靠多次嘗試的方法來進行擴增；
(2)若提高引物退火溫度，則由于亞硫酸鹽處理后，基因組DNA已被打斷成SOObp左右的片段，因此用常規方法設計引物，不容易擴增或者不能擴增；
(3)用高保真的Taq酶(金牌rTaq、LATaq,ExTaq等)擴增效果沒有改善，且成功率低、成本高；
(4)需要對具有甲基化的和非甲基化的位點分別設計引物，比較繁瑣復雜。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種快速高效檢測亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法。為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是一種快速高效檢測亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法，包括如下步驟首先，設計一對外部引物Al和A2，一對內部引物BI和B2 ;其設計方法如下
1)根據已知基因序列設計引物；
2)引物大小為28-35nt，要避免A，T各連續3次以上重復；
3)正向引物末端不能為C;
4)正向引物少于5個C，反向引物少于5個G;
5)正向引物中的C用兼并堿基Y代替C/T;反向引物中的G用兼并堿基R代替G/A ；
6)根據上述原則設計兩對引物，包括一對根據目的片段和/或其側翼序列設計的外部引物(Al和A2)和一對在外部引物擴增片段內設計的內部引物(BI和B2)。通常情況下， Al，BI作為正向引物，A2，B2作為反向引物。其次，PCR擴增，它包括兩輪PCR過程，
第一輪PCR的擴增參數
1)一輪擴增參數95°C或 94°C 45S 或 30S，62°C 45S 或 30S，72°C 60S ；
2)以后每輪退火溫度遞減1°C，擴增9輪；或退火溫度遞減O.7°C，擴增11輪；
3)然后按下列參數擴增25輪95°C或94°C45S或30S，52°C 45S或30S，72°C 60S ；
4)第一輪PCR為降落式PCR，所用引物為Al和A2，或Al和B2，或BI和A2；
第二輪PCR的擴增參數
1)按照下列參數擴增35 輪95°C或 94°C 45S 或 30S，58°C 45S 或 30S，72°C 60S ；
2)普通PCR，所用引物為BI和B2，模板為第一輪PCR產物l_2ul，所用酶為ExTaq或普通 rTaq ；
三)擴增產物小于700bp。本發明所涉及的引物設計思路和PCR技術是經過長時間的實踐經驗得來，適用于所有亞硫酸鹽測序的材料，不分物種，特別適用于植物材料。上述的方法應用于檢測動植物基因組DNA甲基化修飾位點。本發明的有益效果是本發明將兩種PCR程序結合在一起解決了以下問題
(1)降低了亞硫酸鹽測序的成本并提高了實驗效率，本發明只需要設計兩對引物，用ExTaq或普通rTaq，使用2ul亞硫酸鹽處理后的模板DNA便可一次性擴增出目的片段，進而連接轉化到感受態細胞中，挑菌測序；
(2)提高擴增效率，本發明設計兼并引物，只通過一個PCR反應即可把甲基化和未甲基化位點共同擴增出來；
(3)解決了DNA模板因處理后序列改變而引起的常規PCR引物擴增不出和PCR擴增困難的問題。增加引物的長度，并且利用兩對引物之間的聯合擴增來解決這個問題；
(4)采用先降落PCR再普通PCR的方法，解決了普通PCR程序不容易擴增或者不能擴增的問題；并且擴大了引物的組合范圍，比如在降落PCR循環中，既可以使用A1/A2組合，也可以使用A1/B2組合，也可以使用B1/A2組合，只要有清晰的目的片段擴出來，即可再用這一輪的PCR產物進行第二輪的普通PCR擴增(引物均為B1/B2組合)，使用方便，
(5 )本發明適用于所有的高等生物，特別是人類和植物。總之，本發明具有擴增效率高、實驗成本低、實驗周期短、檢測快速易掌握且實驗結果穩定性好、在實驗室中易完成的特點，可以廣泛應用到人類(特別是原癌基因和抑癌基因)、哺乳動物以及植物基因組特定基因的甲基化修飾檢測中。
圖I是實施例I中同一模板經過不同的PCR程序擴增后結果；
M =IOObpmarker ;1_3使用普通PCR程序，退火溫度分別為60°C，55°C和52°C的擴增結果；4-6應用本專利申請的“第I輪PCR擴增”程序的擴增結果，每道表示一次獨立實驗,共三次獨立的重復。圖2是實施例I中第II輪擴增后結果；
如圖所示為兩次獨立重復試驗。圖3是實施例I中亞硫酸鹽測序分析結果展示。圖4是實施例2-4的PCR擴增結果；M: marker ;A_F 擴增產物大小依次為446bp，332bp，493bp，425bp，493bp，402bp。圖5是實施例2-4中亞硫酸鹽測序分析結果展示。
具體實施例方式實施例I 檢測亞硫酸鹽處理后的水稻基因組中位于10號染色體上的反轉座子Tosl7的左側LTR的DNA甲基化修飾的PCR方法
一)設計內部外部引物
1)根據Tosl7在Genebank上的克隆號AC087545在NCBI網站上下載到Tosl7序列，其左側LTR序列為138bp，再通過NCBI網站下載出左側LTR序列上下游各600bp的序列，利用引物設計軟件pimer5按照如下方法設計引物；
2)引物大小為28-35nt，要避免A，T各連續3次以上重復；
3)正向引物末端不能為C;
4)正向引物少于5個C，反向引物少于5個G;
5)正向引物中的C用兼并堿基Y代替C/T;反向引物中的G用兼并堿基R代替G/A ；
6)設計兩對引物，包括一對根據目的片段和/或其側翼序列設計的外部引物(Al和A2)和一對在外部引物擴增片段內設計的內部引物(BI和B2)。其中，使用引物A1/A2擴增目的片段大小為626bp，引物B1/B2組合擴增目的片段大小為266bp，A1/A2擴增片段包含BI/B2擴增片段。引物序列如下
Al: 5’ GTTGGGATYAATGGGATTGGYAAGT 3’
A2: 5’ CCTCRACCTRTRCARCAARCCARCAAC 3’
BI: 5， TGGAYAGATYAAGYYTAAYTTGGGAAG 3，
B2: 5’ RACCATTRCTCTRATACCATCTTAACT 3’
二)PCR擴增，包括兩輪PCR過程，
使用引物A1/A2做第I輪PCR擴增
PCR反應體系25ul，按常規劑量添加，其中ExTaq加O. Iul，亞硫酸鹽處理模板加2ul，按照下列參數進行擴增
1)一輪擴增參數95°C 45S，62°C 45S，72°C 60S ；
2)以后每輪退伙溫度遞減1°C，擴增9輪；
3)接著按下列參數擴增25輪95°C45S，52°C 45S，72°C 60S。按照上述程序擴增，獲得目的產物，大小為626bp。同時，為了驗證本方法的有效性，采用同樣的亞硫酸鹽處理模板，同樣的反應體系，但用普通的PCR程序擴增，則擴增不出目的片段，結果見圖I。如圖I所示為同一模板經過不同的PCR程序擴增后結果。M:IOObpmarker ;1_3使用普通PCR程序，退火溫度分別為60°C，55°C和52°C的擴增結果，只可見彌散條帶，沒有目的產物擴增；4-6應用本專利申請的“第I輪PCR擴增”程序的擴增結果，每道表示一次獨立實驗，共三次獨立的重復，可見有清晰的大小一致的目的片段擴增。使用弓I物B1/B2做第II輪PCR擴增
PCR反應體系25ul，按常規劑量添加，以第I輪PCR擴增產物取Iul為模板，按照下列參數進行擴增
1)擴增35 輪95°C 45S, 58°C 45S，72°C 60S ；
2)普通PCR，所用引物為BI和B2，模板為第一輪PCR產物2ul，所用酶為ExTaqO. Iul0按照上述程序擴增，獲得目的產物，大小為266bp (見圖2)。 三)測序后結果驗證
將經過第II輪PCR擴增后的PCR產物應用常規連接轉化方法后，進行挑菌測序，測序結果顯示，經過兩輪優化的PCR方法進行擴增后，擴增片段的確是實驗設計需要擴增的目的片段，而且包括甲基化的和未甲基化片段，故結果真實可靠(見圖3)。實施例2 檢測亞硫酸鹽處理后水稻基因組中位于7號染色體上的反轉座子Tosl7的左側LTR的DNA甲基化修飾的PCR方法
一)設計內部外部引物
1)根據其在Genebank上的克隆號AP005292在NCBI網站上下載到此序列，它位于七號染色體的186486-190599位置，再通過NCBI網站下載出左側LTR序列上下游各600bp的序列，即位于七號染色體的185886-187086處，利用引物設計軟件pimer5按照如下方法設計引物；
2)引物大小為28-35nt，要避免A，T各連續3次以上重復；
3)正向引物末端不能為C;
4)正向引物少于5個C，反向引物少于5個G;
5)正向引物中的C用兼并堿基Y代替C/T;反向引物中的G用兼并堿基R代替G/A ；
6)設計兩對引物，包括一對根據目的片段和/或其側翼序列設計的外部引物(Al和A2)和一對在外部引物擴增片段內設計的內部引物(BI和B2)。其中，使用引物A1/A2擴增目的片段大小為535bp，A1/B2擴增目的片段大小為446bp，引物B1/B2組合擴增目的片段大小為332bp，A1/A2擴增片段包含B1/B2擴增片段。引物序列如下
Al: 5’ TGTGYATAGGATAYATTYTCGTTGAA 3’
A2: 5’ ATAAATATRAATTRRARRARRTTRCTTA 3’
BI: 5’ YATGTGTGGTTTYTATYAYTYGGATGT 3’
B2: 5’ RTTCARACCATTRCTCTRATACCATCT 3’
二)PCR擴增，包括兩輪PCR過程 使用引物A1/B2做第I輪PCR擴增
PCR反應體系25ul，按常規劑量添加，其中ExTaq加O. Iul，亞硫酸鹽處理模板加2ul，按照下列參數進行擴增
I)一輪擴增參數95°C 45S，62°C 45S，72°C 60S ；2)以后每輪退伙溫度遞減1°C，擴增9輪；
3)接著按下列參數擴增25輪95°C45S, 52°C 45S, 72°C 60S。按照上述程序擴增，獲得目的產物，大小為446bp。(見圖4A道)。使用引物B1/B2做第II輪PCR擴增
PCR反應體系25ul，按常規劑量添加，以第I輪PCR擴增產物取Iul為模板，按照下列參數進行擴增
1)擴增35 輪95°C 45S, 58°C 45S，72°C 60S ；
2)普通PCR，所用引物為BI和B2，模板為第一輪PCR產物2ul，所用酶為ExTaqO. Iul0·
按照上述程序擴增，獲得目的產物，大小為332bp (見圖4B道)。三)測序后結果驗證
將經過第II輪PCR擴增后的PCR產物應用常規連接轉化方法后，進行挑菌測序，測序結果顯示，經過兩輪優化的PCR方法進行擴增后，擴增片段的確是實驗設計需要擴增的目的片段，而且包括甲基化的和未甲基化片段，故結果真實可靠(見圖5A)。實施例3 檢測亞硫酸鹽處理后的GENE BANK中的序列AP001551的DNA甲基化修飾的PCR方法
一)設計內部外部引物
1)根據其在Genebank上的克隆號AP001551在NCBI網站上下載到此序列，它位于一號染色體的59722-64876位置，再通過NCBI網站下載出左側序列上下游各300bp的序列，即位于一號染色體的59422-60022處，利用引物設計軟件pimer5按照如下方法設計引物
2)引物大小為28-35nt，要避免A，T各連續3次以上重復；
3)正向引物末端不能為C;
4)正向引物少于5個C，反向引物少于5個G;
5)利用兼并方法，正向引物中的C用兼并堿基Y代替C/T;反向引物中的G用兼并堿基R代替G/A ；
6)設計兩對引物，包括一對根據目的片段和/或其側翼序列設計的外部引物(Al和A2)和一對在外部引物擴增片段內設計的內部引物(BI和B2)。其中，使用引物A1/A2擴增目的片段大小為493bp，引物B1/B2組合擴增目的片段大小為425bp，A1/A2擴增片段包含BI/B2擴增片段。引物序列如下
Al: 5’ TGTTTGTTAAGTGTTAAYGAAYTYYTGAAG 3’
A2: 5’ TCTTCATTACCARCARATCATRCTACT 3’
BI: 5’ YTGAAAAGAATTAGTGAYTAGTTAGGTG 3’
B2: 5’ ACTATCATRTTRTRAARACTCRCTTTCCA 3’
二)PCR擴增，包括兩輪PCR過程 使用引物A1/A2做第I輪PCR擴增
PCR反應體系25ul，按常規劑量添加，其中ExTaq加O. Iul，亞硫酸鹽處理模板加2ul，按照下列參數進行擴增
1)一輪擴增參數95°C 45S，62°C 45S，72°C 60S ；
2)以后每輪退伙溫度遞減1°C，擴增9輪；
3)接著按下列參數擴增25輪95°C45S, 52°C 45S, 72°C 60S。
按照上述程序擴增，獲得目的產物，大小為493bp。(見圖4C道)。使用引物B1/B2做第II輪PCR擴增
PCR反應體系25ul，按常規劑量添加，以第I輪PCR擴增產物取Iul為模板，按照下列參數進行擴增
1)擴增35 輪95°C 45S, 58°C 45S，72°C 60S ；
2)普通PCR，所用引物為BI和B2，模板為第一輪PCR產物2ul，所用酶為ExTaqO. Iul0按照上述程序擴增，獲得目的產物，大小為425bp (見圖4D道)。三)測序后結果驗證·
將經過第II輪PCR擴增后的PCR產物應用常規連接轉化方法后，進行挑菌測序，測序結果顯示，經過兩輪優化的PCR方法進行擴增后，擴增片段的確是實驗設計需要擴增的目的片段，而且包括甲基化的和未甲基化片段，故結果真實可靠(見圖5B)。實施例4 選取水稻基因組上的一段序列進行DNA甲基化修飾檢測
一)設計內部外部引物
1)在NCBI網站上隨機選取一段序列，它位于三號染色體的63919-64519位置,利用引物設計軟件pimer5按照如下方法設計引物
2)引物大小為28-35nt，要避免A，T各連續3次以上重復；
3)正向引物末端不能為C;
4)正向引物少于5個C，反向引物少于5個G;
5)利用兼并方法，正向引物中的C用兼并堿基Y代替C/T;反向引物中的G用兼并堿基R代替G/A ；
6)設計兩對引物，包括一對根據目的片段和/或其側翼序列設計的外部引物(Al和A2)和一對在外部引物擴增片段內設計的內部引物(BI和B2)。其中，使用引物A1/A2擴增目的片段大小為493bp，引物B1/B2組合擴增目的片段大小為402bp，A1/A2擴增片段包含BI/B2擴增片段。引物序列如下
Al: 5， ATAAATGAAATYAAYATYAYAAAATTG 3，
A2: 5’ ACAATCATRTTRTRAARACTCRCTTTCC 3’
BI: 5’ YTGYATGGYAGYATAAGYAAAGTGTAA 3’
B2: 5’ TRAARACTCRCTTTCCARATRCTCCA 3’
二)亞硫酸處理
1)用EZ DNA Methylation-Gold Kit 處理基因組 DNA，添加 130uL 制備好的 CTConversion Reagent 到 20uLDNA 樣品中，混合；
2)按照以下溫度放置98°C放置10分鐘，64°C放置2.5個小時，然后4°C下保存；
3)添加600uL 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin IC Column 中，然后添加 DNA 樣品,蓋上蓋并且通過反復顛倒柱數次來混合；
4)全速(>10,000*g)離心30秒，去除流出液；
5)添加200uL的M-ffashBuffer到柱中，離心30秒；
6)添加200uL的M-DesulphonationBuffer到柱中并且放置15-20分鐘,全速離心30
秒；
7)添加200uL的M-WashBuffer到柱中，離心30秒，重復此步驟數次；8)直接添加IOuL的M-Elution Buffer到柱基質中，放置到I. 5mL管中，離心來洗脫出 DNA。三)PCR擴增包括兩輪PCR擴增 使用引物A1/A2做第I輪PCR擴增
PCR反應體系25ul，按常規劑量添加，按照下列參數進行擴增
1)一輪擴增參數95°C 45S，62°C 45S，72°C 60S ；
2)以后每輪退伙溫度遞減1°C，擴增9輪；
3)接著按下列參數擴增25輪95°C45S, 52°C 45S, 72°C 60S ；
按照上述程序擴增，獲得目的產物，大小為493bp。(見圖4E道)。
使用引物B1/B2做第II輪PCR擴增
PCR反應體系25ul，按常規劑量添加，以第I輪PCR擴增產物取Iul為模板，按照下列參數進行擴增
1)擴增35 輪95°C 45S, 58°C 45S，72°C 60S ；
2)普通PCR，所用引物為BI和B2，模板為第一輪PCR產物2ul，所用酶為ExTaqO. Iul0按照上述程序擴增，獲得目的產物，大小為402bp (見圖4F道)。四)測序
將經過第II輪PCR擴增后的PCR產物應用常規連接轉化方法后，進行挑菌測序，測序結果通過http://www. gmi. oeaw. ac. at/CyMATE/進行甲基化分析，結果顯示，經過兩輪優化的PCR方法進行擴增后，擴增片段的確是實驗設計需要擴增的目的片段，而且包括甲基化的和未甲基化片段，故結果真實可靠(見圖5C)。
權利要求
1.一種快速高效檢測亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法，其特征在于包括如下步驟 一)設計一對外部引物Al和A2，一對內部引物BI和B2; 二)PCR擴增包括兩輪PCR過程， 第一輪PCR的擴增參數 1)一輪擴增參數95°C或 94°C 45S 或 30S，62°C 45S 或 30S，72°C 60S ； 2)以后每輪退火溫度遞減1°C，擴增9輪；或退火溫度遞減O.7°C，擴增11輪；3)然后按下列參數擴增25輪95°C或94°C45S或30S，52°C 45S或30S，72°C 60S ； 4)第一輪PCR為降落式PCR，所用引物為Al和A2，或Al和B2，或BI和A2； 第二輪PCR的擴增參數1)按照下列參數擴增35 輪95°C或 94°C 45S 或 30S，58°C 45S 或 30S，72°C 60S ； 2)普通PCR，所用引物為BI和B2，模板為第一輪PCR產物l_2ul，所用酶為ExTaq或普通 rTaq ； 三)擴增產物小于700bp。
2.按照權利要求I所述的一種快速高效檢測亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法，其特征在于所述的設計一對外部引物Al和A2，一對內部引物BI和B2的方法如下 1)根據已知基因序列設計引物； 2)引物大小為28-35nt，要避免A，T各連續3次以上的重復； 3)正向引物末端不能是C; 4)正向引物少于5個C，反向引物少于5個G;5)正向引物中的C用兼并堿基Y代替C/T;反向引物中的G用兼并堿基R代替G/A ； 6)按照上述方法，根據目的片段和/或其側翼序列設計外部引物Al和A2，和一對在外部引物擴增片段內設計的內部引物BI和B2。
3.權利要求I或2所述的方法在檢測動植物基因組DNA甲基化修飾位點中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種快速高效檢測亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法。采用的技術方案是1)設計一對外部引物A1和A2，一對內部引物B1和B2；2)PCR擴增包括兩輪PCR過程，第一輪PCR為降落式PCR，所用引物為A1和A2，或A1和B2，或B1和A2；第二輪PCR的擴增為普通PCR，所用引物為B1和B2，模板為第一輪PCR產物1-2ul，所用酶為ExTaq或普通rTaq；3)擴增產物小于700bp。本發明具有擴增效率高、實驗成本低、實驗周期短、檢測快速易掌握且實驗結果穩定性好、在實驗室中易完成的特點，可以廣泛應用到人類、哺乳動物以及植物基因組特定基因的甲基化修飾檢測中。
文檔編號C12Q1/68GK102888461SQ20121038874
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者王紅艷, 王秋雨, 韓陽, 周嬋, 王錚 申請人:遼寧大學