一種高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法
【專利摘要】本發明公開了一種高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步驟：步驟1）制備反應液；步驟2）將上述反應液放入63℃烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性;步驟3）提取臨床分離單核細胞增生李斯特氏菌，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。本發明通過配制反應液，設計引物序列，能快速、準確的檢測單核細胞增生李斯特氏菌，并及時采取相應的措施，減少了疾病的發生率。
【專利說明】一種高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及疾病檢測【技術領域】，具體的說，是一種高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法。
【背景技術】
[0002]單核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種常見的土壤細菌,它也是某些食物(主要是鮮奶產品)中的一種污染物，能引起嚴重食物中毒。單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4°C的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。急需特異性和敏感度高的快速診斷試劑。
[0003]環介導等溫擴增技術是由日本榮研(EIKEN)株式會社開發的高特異性敏感度的核酸檢測系統，無須昂貴的設備，已經成為核酸快速檢測法的良好手段，本發明結合環介導等溫擴增技術，設計針對單核增生李斯特菌特異性基因序列的一對外引物(L-F3和L-B3)和一對內引物(L-FIP和L-BIP)進行環介導等溫擴增。
【發明內容】
[0004]本發明公開了 一種高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，提高了它的檢測和診斷效率。
[0005]為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現:
一種高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應液
反應液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內引物
L-FIP40umol
L-BIP40umol
外引物
L-F35umol
L-B35umol
標本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul;
步驟2)將上述反應液放入63°C烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性；
步驟3)提取臨床分離單 核細胞增生李斯特氏菌，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。
[0006]進一步的，所述外引物L-F3 的序列為 GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT。
[0007]進一步的，所述外弓丨物L-B3的序列為GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT。
進一步的，所述內引物L-FIP的序列為 GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCCo
[0008]進一步的，所述內引物L-BIP 的序列為 TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC。
[0009]進一步的，所述反應液中加入熒光顯示物質溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
[0010]本發明的有益效果是:
本發明通過配制反應液，設計引物序列，能快速、準確的檢測單核細胞增生李斯特氏菌，并及時采取相應的措施，減少了疾病的發生率。
【具體實施方式】
[0011]下面將結合實施例，來詳細說明本發明。 [0012]一種高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應液
反應液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內引物
L-FIP40umol
L-BIP40umol
外引物
L-F35umol
L-B35umol
標本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul。
[0013]選取單核細胞增生李斯特氏菌特異性基因從F基因(基因序列來源美國國立生物技術信息中心-NCBI)，設計引物序列。所述外引物L-F3的序列為GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT，所述外引物 L-B3 的序列為 GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT，所述內引物L-FIP的序列為
GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-AITTCAAATAAACTTGACGGCC，所述內引物 L-BIP 的序列為 TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC。
[0014]進一步的，所述反應液中加入熒光顯示物質溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
[0015]步驟2)將上述反應液放入63°C烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性；
步驟3)提取臨床分離單核細胞增生李斯特氏菌2株，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。結果顯示:2株單核細胞增生李斯特氏菌每次均為陽性，其余菌種為陰性。
[0016]以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的`保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)制備反應液 反應液組成及含量為 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐熱聚合酶反應緩沖液lX，MgS04 2mM4M甜菜堿IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 內引物 L-FIP40umol L-BIP40umol 外引物 L-F35umol L-B35umol標本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul; 步驟2)將上述反應液放入63°C烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性； 步驟3)提取臨床分離單核細胞增生李斯特氏菌，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應，觀察它們的陰陽性。
2.根據權利要求1所述的高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述外引物L-F3的序列為GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT。
3.根據權利要求2所述的高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述外引物L-B3的序列為GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT。
4.根據權利要求3所述的高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述內引物L-FIP的序列為
GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCCo
5.根據權利要求4所述的高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述內引物 L-BIP 的序列為 TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC0
6.根據權利要求5所述的高特異高敏感檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述反應液中加入熒光顯示物質溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
【文檔編號】C12Q1/04GK103725763SQ201210385668
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月12日 優先權日:2012年10月12日
【發明者】金京勛 申請人:蘇州四同醫藥科技有限公司