Graves病基因無創檢測試劑盒（TSHR等基因）的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種檢測Graves病基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rs179247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與Graves病發生密切相關的3個單核苷酸多態性位點的基因型從基因層面來評估Graves病發病的風險級別，指導人們提早預防Graves疾病的發生。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】Graves病基因無創檢測試劑盒(TSHR等基因)
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種Graves病的基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估Graves病發生的風險級別，并且指導Graves病高危人群提早預防和治療。
【背景技術】
[0002]Graves病(GD)是一種伴有甲狀腺激素增多的器官特異性自身免疫性疾病，它的發生具有一定的遺傳因素。以促甲狀腺素受體抗體(TRAb)陽性、高甲狀腺素血癥、Graves眼病、彌漫性甲狀腺腫和脛前黏液性水腫為特征。Graves病的發生呈明顯的家族聚集性，患者家族成員的患病風險為正常人群的15倍，而且同卵雙生子的患病一致率顯著高于異卵雙生子。大量的流行病學研究為其遺傳易感提供了確鑿的證據。單核苷酸多態性(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)指的是基因組序列上的單個堿基突變。作為第三代遺傳學標記，SNP在疾病易感基因的研究中有著重要的意義。通過分子診斷檢測與Graves病發生密切相關的基因位點就可以提前評估受檢者患Graves病的風險，從而提早預防和治療。
[0003]細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原 4(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen4，CTLA-4)是一種免疫調節分子。近年的研究表明:CTLA-4基因多態性與多種自身免疫性疾病的發生風險相關。CTLA-4基因上外顯子I第17密碼子49位點A/G多態性造成CTLA-4信號肽中編碼氨基酸的改變，從而影響蛋 白翻譯后加工、修飾，使sCTLA-4功能發生變化。研究發現GD患者等位基因G/G和G基因頻率在GD組均較對照組顯著增加，提示CTLA-4G49可能是GD的易感因素，CTLA-4基因可能是GD的易感候選基因。
[0004]促甲狀腺素受體(TSHR)基因能夠編碼一種特異的蛋白質TSHR，表達在甲狀腺濾泡細胞表面，調節甲狀腺的增殖分化和甲狀腺激素的合成。在Graves病中TSHR基因區域的遺傳變異可能通過改變正常TSHR的結構、表達量以及翻譯后過程，引起機體針對TSHR的自身免疫反應。今年來，大樣本的研究已經明確了 TSHR基因和Graves病的發生密切相關，其中最值得關注的區域定位于TSHR基因內含子I上。對1000多例Graves病患者和1000多名健康對照者進行TSHR rsl79247基因分型，得到3種基因型:AA、AG、GG，其中病例組AA基因型頻率和A等位基因明顯高于對照組。提示TSHR rsl79247是Graves病的獨立易感位點。
[0005]FcRL3基因包含16個外顯子，在淋巴細胞聚集區如成熟B細胞中高表達。近年來的國內外研究數據顯示，FcRL3基因多態位點不但與GD相關，還與多發性硬化、系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎等多種自身免疫性疾病相關。研究發現FcRL3基因啟動子rs7528684位點存在A / G多態性，而且⑶病患組的GG基因型和G等位基因頻率均明顯高于正常對照組。提示FcRL3基因可能是GD等自身免疫性疾病的遺傳標志之一。
[0006]因此，建立簡單、快速的Graves病易感基因無創檢測方法,能夠檢測出Graves病發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患Graves病的高危人群，有針對性的進行孕期檢測和指導，對于降低人群得病率、保障大眾的安全健康具有非常重要的意義。
【發明內容】
[0007]基于CTLA-4 基因上 A49G(rs231775)、TSHR 基因上 rsl79247、FcRL3 基因上rs7528684的3個單核苷酸多態性位點基因型可用來評估Graves病發病風險級別，本發明提供一種Graves病基因無創檢測試劑盒。
[0008]該試劑盒包括:
檢測 CTLA-4 基因上 A49G(rs231775) ,TSHR 基因上 rsl79247、FcRL3 基因上 rs7528684的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；
PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；
PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本發明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應體系:10 XPCR 反應緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 產物純化體系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；測序反應體系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul ；
本試劑盒供一人份檢測使用，`試劑盒的保存溫度為_20°C。
【具體實施方式】
[0010]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0011]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0012]實施例1.檢測試劑盒的使用。
[0013]1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0014]2、PCR擴增反應
使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對:
(1)CTLA-4 (A49G)正向引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA3’
CTLA-4 (A49G)反向引物:5’GAATACAGAGCCAGCCAAGC3’
(2)TSHR (rsl79247)正向引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’
TSHR (rsl79247)反向引物:5’ ATACTGCCATCTCAAAGCC 3’
(3 ) FcRL3 (rs7528684)正向引物:5’ AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’
FcRL3 (rs7528684)反向引物:5’GGTGGAACCTCTTTGATTGC3’。
[0015]PCR擴增的反應體系為:10 X PCR反應緩沖液2.5ml ；25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0016]反應條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0017]3、PCR擴增產物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0018]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0019]4、DNA測序反應
使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)CTLA-4 (A49G)測序引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA 3’
(2)TSHR (rsl79247)測序引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’
(3)FcRL3 (rs7528684)測序引物:5’AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’。
[0020]反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水 2ul。
[0021]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98°C 2min，進行25個循環的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0022]反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
[0023]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0024]實施例2.為人群進行Graves病基因無創檢測的服務。
[0025]1.采樣及抽提DNA
由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
[0026]2.基因型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的CTLA-4基因上A49G (rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。
[0027]3.Graves病高危人群風險評估分析
通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具Graves病風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rs 179247、FcRL3基因上rs7528684的SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀Graves病基因無創檢測報告單。
【權利要求】
1.一種篩查Graves病高危人群的基因無創檢測試劑盒，其特征在于:檢測CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對CTLA-4基因上A49G (rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下: (1)CTLA-4 (A49G)正向引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA3’ CTLA-4 (A49G)反向引物:5’ GAATACAGAGCCAGCCAAGC3’ (2)TSHR (rsl79247)正向引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’ TSHR (rsl79247)反向引物:5’ ATACTGCCATCTCAAAGCC 3’
(3 ) FcRL3 (rs752 8684)正向引物:5’ AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’
FcRL3 (rs7528684)反向引物:5’GGTGGAACCTCTTTGATTGC3’。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下: (1)CTLA-4 (A49G)測序引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA 3’ (2)TSHR (rsl79247)測序引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’
(3)FcRL3 (rs7528684)測序引物:5’ AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應體系:10父？0?反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測序反應體系:25%BigDye mixlul, 3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710424SQ201210373800
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年10月2日 優先權日:2012年10月2日
【發明者】石慧林 申請人:解碼（上海）生物醫藥科技有限公司