肥胖易感性無創檢測試劑盒（lepr等基因）的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測肥胖基因突變位點方法，檢測探針以及檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測GNB3基因上C825T、LEPR基因上Gln223Arg、UCP2基因上-866G/A的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與檢測探針、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與肥胖癥發生密切相關的3個單核苷酸多態性位點的基因型，從基因層面來評估肥胖癥的風險級別，提早預防肥胖癥的發病。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】肥胖易感性無創檢測試劑盒(LEPR等基因)
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種肥胖癥的基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估疾病發生的風險級別，并且指導肥胖高危人群提早預防和治療。
【背景技術】
[0002]肥胖病是指機體脂肪總含量過多和(或)局部體脂含量過多，是由遺傳和環境因素共同作用所致的慢性代謝性疾病。隨著生活水平的不斷提高，生活方式的改變，我國居民超重和肥胖率呈明顯上升的趨勢。兒童單純性肥胖的發病率逐年增加，已被國際兒科界列為21世紀兒童健康的重要課題之一。肥胖可依據脂肪堆積部位分為兩類:一類以總體脂增加，脂肪積聚于臀部、大腿等處為特點，稱為皮下脂肪型肥胖，亦即全身性肥胖；另一類以脂肪主要積聚于腹部，尤其是腹腔內為特點，稱為內臟型肥胖，亦即中心型肥胖。超重和肥胖與高血壓、2型糖尿病等慢性非傳染性疾病密切相關，其中，中心型肥胖與心血管疾病及胰島素抵抗綜合癥的發生具有更高的相關性。
[0003]肥胖的病因相當復雜，遺傳因素在肥胖的發生機制中占據重要地位。涉及到能量消耗或能量攝取的基因與肥胖的發生有關。人類的肥胖病患者大多表現為高瘦素水平，存在瘦素抵抗狀態，因此瘦素受體(Leptin receptor, LEPR)作為瘦素調節機體攝食及能量代謝的信號傳遞中介受到高度重視。而研究瘦素受體多態性與能量代謝各指標的關系對于揭示肥胖及其相關疾病的共同遺傳背景有著很重要的意義。由于LEPR基因外顯子第668個核苷酸A —G替換，谷氨酸被精氨酸替換(Gln223Arg)。該位點的帶電性由中性轉向正電荷，能夠影響LEPR的功能并改變其信號傳遞能力。推測Gln223Arg基因多態性也可能對LEPR信號傳導通路產生了影響，從而參與了瘦素抵抗性肥胖的發病機制。
[0004]解偶聯蛋白(UCP)是線粒體內膜轉運載體，UCP的基因多態性可影響mRNA的轉錄及蛋白質的表達，進而影響基礎代謝率，從而改變人的肥胖易感性。解偶聯蛋白2 (uncoupling proteins 2, UCP2)基因定位于llql3染色體,是UCP家族成員之一。大量研究表明，UCP2基因是肥胖相關基因之一。鄒恒昀等的研究發現男性中-866G/A多態性與肥胖有關，男性中GG基因型個體相對AA基因型具有更高的肥胖率，這與Harald等對698個奧地利人的研究結果一致，相對G等位基因，A等位基因的攜帶者具有較低的肥胖率。一系列研究還表明UCP2基因多態性與冠心病、2型糖尿病等疾病也有相關性。
[0005]G蛋白β3亞單位上的GNB3基因存在著多態C825T位點。GNB3基因825位上的多態性是指GNB3基因中第10個外顯子的825位發生了胞嘧啶核苷酸(C)和胸腺核苷酸(T)的改變。國內外學者對大量人群的C825T等位基因分析研究表明，該位點的多態性與肥胖存在相關性。還發現GNB3基因825位點多態性與孕婦產后正常體重恢復有關。GNB3基因型與機體脂肪含量有關，基因型825Τ/Τ脂肪含量顯著高于基因型825T/C和825C/C。
[0006]因此，建立簡單、快速的肥胖易感基因檢測方法，及時篩查出易患肥胖癥的高危人群，有針對性的進行健康指導和預防，對于保障人類安全健康具有非常重要的意義。
【發明內容】
[0007]基于GNB3 基因上 C825T、LEPR 基因上 Gln223Arg、UCP2 基因上-866G/A 的 3 個SNPs位點基因型可用來評估肥胖癥發病風險級別，本發明提供一種肥胖癥基因檢測試劑盒。
[0008]該試劑盒包括: 檢測 GNB3 基因上 C825T、LEPR 基因上 Gln223Arg、UCP2 基因上-866G/A 的 3 個 SNPs位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物。
[0009]PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)。
[0010]PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0011]DNA測序反應組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0012]本發明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應體系:10 XPCR 反應緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0013]PCR 產物純化體系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0014]測序反應體系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0015]本試劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0017]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0018]實施例1.檢測試劑盒的使用。
[0019]1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0020]2、PCR擴增反應
使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對:
(1)GNB3 (C825T)正向引物:5’- TTCCTGCCGCTTGTTTGA-3’
GNB3 (C825T)反向引物:5’ - AAATGCCAGGAACCCAGAA-3’
(2)LEPR (Gln223Arg)正向引物:5’ - AAACTCAACGACACTCTCCTT-3’
LEPR (Gln223Arg)反向引物:5’ - ACTGACATTAGAGGTGAC-3’
(3)UCP2 (-866G/A)正向引物:5’- CACGCTGCTTCTGCCAGGAC-3，
UCP2 (-866G/A)反向引物:5’ - AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。[0021 ] PCR擴增的反應體系為:10 X PCR反應緩沖液2.5ml ；25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0022]反應條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0023]3、PCR擴增產物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0024]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0025]4、DNA測序反應
使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)GNB3 (C825T)測序引物:5’- TTCCTGCCGCTTGTTTGA-3’
(2)LEPR (Gln223Arg)測序引物:5，- AAACTCAACGACACTCTCCTT -3，
(3)UCP2 (-866G/A)測序引物:5，- CACGCTGCTTCTGCCAGGAC -3，。
[0026]反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水2ul。
[0027]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0028]反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
[0029]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0030]實施例2.為人群進行肥胖癥基因檢測的服務。
[0031]1.采樣及抽提DNA
由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
[0032]2.基因型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的GNB3基因上C825T、LEPR基因上Gln223Arg、UCP2基因上-866G/A的3個SNPs位點分別進行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。
[0033]3.肥胖癥基因高危人群風險評估分析
通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具肥胖癥風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者GNB3基因上C825T、LEPR基因上Gln223Arg、UCP2基因上-866G/A的3個SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀肥胖癥基因檢測報告單。
【權利要求】
1.一種篩查肥胖癥高危人群的基因無創檢測試劑盒，其特征在于:檢測GNB3基因上C825T、LEPR基因上Gln223Arg、UCP2基因上-866G/A的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA檢測探針、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDyemix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對GNB3基因上C825T、LEPR基因上Gln223Arg、UCP2基因上-866G/A的3個單核苷酸多態性(SNPs)位點，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對GNB3基因上C825T、LEPR基因上Gln223Arg、UCP2基因上-866G/A的3個SNPs位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下: (1)GNB3 (C825T)正向引物:5’- TTCCTGCCGCTTGTTTGA-3’ GNB3 (C825T)反向引物:5’ - AAATGCCAGGAACCCAGAA-3’
(2)LEPR (Gln223Arg)正向引物:5’ - AAACTCAACGACACTCTCCTT-3’
LEPR (Gln223Arg)反向引物:5’ - ACTGACATTAGAGGTGAC-3’
(3)UCP2 (-866G/A)正向引物:5’- CACGCTGCTTCTGCCAGGAC-3，
UCP2 (-866G/A)反向引物:5’ - AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下: (1)GNB3 (C825T)測序引物:5’- TTCCTGCCGCTTGTTTGA-3’
(2)LEPR (Gln223Arg)測序引物:5，- AAACTCAACGACACTCTCCTT -3，
(3)UCP2 (-866G/A)測序引物:5，- CACGCTGCTTCTGCCAGGAC -3，。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應體系:10父？0?反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ；
(2)PCR 產物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測序反應體系:25%BigDye mixlul，3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710423SQ201210373799
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年10月2日 優先權日:2012年10月2日
【發明者】石慧林 申請人:解碼（上海）生物醫藥科技有限公司