一株生產己二酸前體物順,順-粘康酸的大腸埃希氏菌及應用的制作方法
【專利摘要】順，順-粘康酸是一種重要的化工有機酸，該產品具有廣泛的用途，可以作為己二酸的前體物。把順，順-粘康酸氫化轉化為己二酸就可以用于生產尼龍66等聚合物。本發明利用組合代謝工程的方法，把不同微生物來源、經過密碼子優化的3-脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶、兒茶酚1，2-雙氧化酶以及人工設計的組成型啟動子和終止子組合成異源表達模塊，并導入莽草酸脫氫酶突變的大腸埃希氏菌中構建了一株生產順，順-粘康酸的重組大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)TIB-LEc340?CGMCC?No?6435。大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)TIB-LEc340CGMCC?No?6435在30℃-40℃發酵16小時-120小時，得到的發酵液中順，順-粘康酸粘康酸的含量最高可達52g/L，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】—株生產己二酸前體物順，順-粘康酸的大腸埃希氏菌及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及到生產己二酸前體物順，順-粘康酸的代謝工程菌,大腸埃希氏菌(Escherichia coli) TIB-LEc340 CGMCC No 6435和利用該菌發酵生產順，順-粘康酸的方法。
【背景技術】
[0002]己二酸(Adipic acid)是六碳二元酸，具有脂肪族二元酸的通性，能發生成鹽反應、酯化反應、酰胺反應，能與二元胺縮合成高分子聚合物，是生產己二胺、尼龍66、纖維和工程塑料及其樹脂的重要工業基礎原料(van Duuren JB, Brehmer B, Mars AE, Eggink G,Dos Santos VA, Sanders JP.A limited LCA of bio—adipic acid !Manufacturing thenylon-6,6 precursor adipic acid using the benzoic acid degradation pathway fromdifferent feedstocks.Biotechnol Bioeng.2011 108(6):1298-306) ?統計表明，全球己二酸消耗量超過300萬噸，其中尼龍66纖維占37%，尼龍66樹脂占25%，聚氨酯占25%。我國的消耗量超過了 50萬噸。我國的己二酸需求量每年都在增長，聚氨酯生產企業的需求量每年增長在10%以上。
[0003]當前己二酸的生產主要是以環己烷為原料的硝酸氧化法，占全球生產能力的90%以上。該法中硝酸的使用嚴重腐蝕設備，而且產生的副產物氮氧化物被認為是引起全球變曖和臭氧減少的原因之一，給環境造成了極大的污染。因此，研究開發新的清潔無害己二酸生產工藝越來越受到人們的重視。微生物轉化生產己二酸有幾十年的研究經歷，不動桿菌、短桿菌、假單胞菌和黃色桿菌等屬微生物可以轉化苯甲酸、兒荼酚、環己醇、環己烷等化合物生產己二酸(Cheng Q, Thomas SMiKostichka K，Valentine JRiNagarajan V.Geneticanalysis of a gene cluster for cyclohexanol oxidation in Acinetobactersp.strain SE19 by in vitro transosition.J Bacteriol.2000 182(17):4744-4751.)，這些生物轉化不需要化學催化劑、氧化劑以及溶劑，是潔凈無害的生產工藝。但是微生物的轉化生廣能力和效率有待進一步提1?。
[0004]然而，化學法和微生物轉化法生產己二酸所需的苯類原料需要來自于石油資源，是不可再生的。因此利用可再生的生物質資源代替石油資源來生產己二酸是可持續發展的需要。近年來，隨著工業生物技術的快速進步，特別是基因合成與遺傳改造、代謝工程與合成生物學以及系統生物學等的快速進步發展(Keasling JD.Manufacturingmolecules through metabolic engineering.Science.2010330(6009):1355-8;Na D， Kim TY, Lee SY.Construction and optimization of synthetic pathways inmetabolic engineering.Curr Opin Microbiol.201013 (3):363-70 ;Dhamankar H，Prather KL.Microbial chemical factories:recent advances in pathway engineeringfor synthesis of value added chemicals.Curr Opin Struct Biol.2011 21(4):488-94 ；Du J，Shao Z，Zhao H.Engineering microbial factories for synthesis ofvalue-added products.J Ind Microbiol Biotechnol.201138(8):873-90)，設計、合成生產己二酸及其前體化合物的實用人工細胞工廠，從可再生的生物質資源生物制造己二酸引起了人們的極大關注(Burgard AP，Pharkya Osterhout RE.Microorganismsfor the production of adipic acid and other compounds.US Patent US7799545B2 ；Fruchey OS，Manzer LE, Dunuwila D，Keen BT, Albin BA，Clinton NA，DombekBD.Processes for producing adipic acid from fermentation broths containingdiammonium adipate.US Patent Application Publication，US 2011/0269993A1 ；BurgardAP, Pharkya Osterhout RE.Microorganisms and methods for the biosynthesis ofadipate, hexamethylenediamine and 6-aminocaproic acid..US Patent ApplicationPublication，US2010/0317069A1 ；Wu L, Trefzer AC，de Wilddeman S，van den Berg,B.Adipate ester or thioester synthesis.W0/2009/113853.)。
[0005]美國密歇根州立大學John Frost研究組通過來源于不同的微生物的3-脫氫莽草酸脫水酶(3-dehydroshikimate dehydratase，AroZ)，原兒荼酸脫羧酶(Protocatechuatedecarboxylase，AroY)和兒荼酌I，2_雙氧化酶(Catechol-1，2-dioxygenase，CatA)組成的異源合成途徑。把異源合成途徑轉入大腸埃希氏菌后催化3-脫氫莽草酸轉化為順，順-粘康酸，初步打通了從來源于可再生資源的葡萄糖到順，順-粘康酸的生化合成通道(FrostJW, Draths KM.Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources.USPatent 5487987，1996 ;Niu W,Draths KM,Frost JW.Benzene-free synthesis of adipicacid.Biotech Prog.2002 18:201-212.)。發酵液中的順，順-粘康酸可以以鉬為催化劑、在低壓室溫下化學氫化轉化為己二酸，該步轉化率在95%以上(Niu W，Draths KM，FrostJW.Benzene-free synthesis of adipic acid.Biotech Prog.2002 18:201-212 ;ThomasJM,Raja R，Johnson BF,Or Connell TJ,Sankar GiKhimyak T.Bimetallic nanocatalystsfor the conversion of muconic acid to adipic acid.Chem Commun(Camb).2003(10):1126-7.)。然而John Frost等人開發己二酸生物合成途徑需要添加昂貴的誘導劑異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)來進行順，順-粘康酸生產。IPTG的使用會從而增加過程費用，限制將來的大規模工業化生產。
[0006]對于己二酸等大宗化學品而言，由于價值相對不高，提高合成和生產效率是影響其生產成本降低、產業開發的根本前提。由于順，順-粘康酸到己二酸的轉化過程非常容易實現，而且轉化效率高、成本較低。因此要通過順，順-粘康酸實現的己二酸生產，關鍵是怎樣有效提高葡萄糖到順，順-粘康酸的產量和產率。根據合成途徑的碳流量分析表明，I摩爾葡萄糖在理論上可以生產出0.75摩爾的順，順-粘康酸，即理論糖酸轉化率為0.60g/g。目前報道最高轉化率只有理論轉化率的33 %，其他原料葡萄糖由于異源合成途徑的代謝不平衡、乙酸等副產物積累、能量代謝以及分支途徑的分流等原因而被損失浪費掉了。所以必須消除這些碳硫(carbon flow)的損失,引導更多的碳硫流向目標產物合成的方向,提高產物的產率(轉化率)。另外，在細胞內代謝途徑往往不是獨立的，而是存在于復雜的代謝網絡中，受到各種各樣的調控，影響著目標產物的過量積累。為了使細胞工廠能夠定向、高效地積累人們所需要的目標生物產品和生物過程，就必須去干擾、改變或修飾細胞原有的調控體系，提高目標產物的產量。針對以上問題，為了提高己二酸及其前體化合物的(生物)合成能力和效率，必須從代謝調控與細胞代謝網絡優化的關鍵科學問題出發，深入發掘和研究各種重要影響因素，通過優化改造提高目標產品的生產效率。
[0007]己二酸及其前體物的生物制造將具有污染少、產品質量高等優點，極具發展前景。但是高效、經濟性地實現己二酸及其前體物的生物制造，仍然有一系列的關鍵技術，其中高性能生產菌株的選育改造是實現己二酸及其前體物生物制造的核心，其他包括發酵工藝的優化和產物的綠色分離純化等也需要進一步的研究和開發。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一株能夠生產己二酸前體物順，順-粘康酸的大腸埃希氏菌和發酵法生產順，順-粘康酸的方法及應用。
[0009]本發明所提供的順,順-粘康酸生產酵母菌為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB-LEc340已于2012年8月16日藏保于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCC)，保藏號為 CGMCC No 6435。
[0010]利用組合代謝工程策略引入由來自不同微生物的3-脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚I，2-雙氧化酶組成的異源代謝途徑催化芳香族氨基酸合成途徑的中間產物3-脫氫莽草酸經原兒茶酸、兒茶酚轉化為順，順-粘康酸，把合成途徑轉入莽草酸脫氫酶(AroE)突變、芳香族氨基酸合成途徑阻斷的大腸埃希氏菌AB2834 (Escherichia coliAB2834)中，構建了能從葡萄糖生產順，順-粘康酸大腸埃希氏菌。
[0011]本發明的另一個目的提供了一種發酵生產己二酸前體物-順，順-粘康酸的方法。
[0012]本發明所提供的生產順,順-粘康酸的方法,是發酵大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 得到順，順-粘康酸。
[0013]利用大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 生產順，順-粘康酸的培養基，包括碳源、氮源和無機鹽。所述碳源可為質量百分含量1-20%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物質水解糖液；所述氮源可為質量百分含量為0.1% -3%的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆餅粉和/或花生柏和/或銨鹽和/或硝酸鹽和/或尿素；所述無機鹽包括質量百分含量^ 0.1% -0.8% Na2HPO4,0.05-0.5% KH2PO4,0.01% -0.1% NaCl, 0.005% -0.1 % MgSO4 和
0.005-0.05% CaCl20為了提高順，順-粘康酸的產量，所述培養基中還含有質量百分含量為0.001-0.008%的莽草酸。
[0014]本發明的發酵大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 在30°C _40°C發酵16小時-120小時，得到的發酵液中順，順-粘康酸粘康酸的含量最高可達52g/L，具有廣泛的應用前景。
[0015]具體實施
[0016]以下為列舉的實施例，以便于更好地理解本發明。
[0017]實施例1 3-脫氫莽草酸脫水酶基因，原兒茶酸脫羧酶基因和兒茶酚1，2_雙氧化酶基因的優化設計合成
[0018]分別根據Klebsiella pneumoniae A170-40的3_脫氫莽草酸脫水酶基因aroZ、原兒茶酸脫羧酶基因aroY和Acinetobacter calcoaceticus的兒茶酌.1，2_雙氧化酶基因catA的序列，通過密碼子優化獲得適合大腸埃希氏菌密碼子偏好性的新基因aroZ-jCat，aroY-jCat和catA-jCat (附圖1-3)，然后利用DNA化學合成的方法獲得這些設計優化的基因，可用于異源合成途徑的創建。
[0019]實施例2 3-脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1，2-雙氧化酶組成的異源表達模塊組裝
[0020]通過合適的限制性內切酶，把人工設計合成的組成型啟動子P3 (TCTAGAATATGTTATCTCTGGCGGTGTTGACATTTCCGTTTTTTCATGATATAATCGCTCCTGAGCGGATAACAATTTCAAGGAGGACAGCTCCATCAT)、上述設計合成的新基因aroZ-jCat, aroY-jCat和catA-jCat以及人工設計合成的終止子 T1(CCGGCTTATCGGTCAGTTTCACCTGAITTACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGITITTGCTITTGGAGGGGCAGAAAGATGAATGACTGTCCACGACGCTATACCCAAAAGAAA)連接起來組成的異源表達模塊CCMA。P3，aroZ-jCat，aroY-jCat，catA-jCat 和 Tl 之間的限制性內切酶分別是 Ndel，SacI，NheI，XhoI。另外分別在aroY-jCat和catA-jCat基因的起始密碼子ATG前加入RBS結合區(AAGAAGGAGATATAGTA)。CCMA模塊的示意圖和序列分別見附圖4和5。
[0021]實施例3 大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 的構建
[0022]將上述構建3-脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1，2_雙氧化酶異源表達模塊CCMA的DNA序列兩端分別加上ClaI和SalI限制性酶切位點，然后把該DNA片段插入質粒PACYC184的相應位點，得到重組質粒pACYC-CCMA(附圖6)。然后把重組質粒pACYC-CCMA轉入莽草酸脫氫酶(AroE)突變的大腸埃希氏菌AB2834(Escherichia coliAB2834)中，獲得目標菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435。
[0023]實施例4 大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 搖瓶發酵生產順，順-粘康酸
[0024]大腸埃希氏菌( Escherichiacoli) TIB_LEc340 CGMCC No 6435 接種裝有 25mL 發酵培養基的500mL搖瓶中，該培養基的pH為7.0，含有下述質量百分比的組分:葡萄糖2%，NH4Cl 0.5%,NaCl 0.1%,Na2HPO4 0.3%,KH2PO4 0.1%,MgSO4.7Η20 0.05%,CaCl 0.01%,莽草酸0.004%。在37°C、220r/min的搖床發酵24小時后，離心分離菌體，按常規方法測定上清液中含有順，順-粘康酸為1.5g/l。
[0025]實施例5 大腸埃希氏菌(Escherichia coli) TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的 5L發酵罐發酵生產順，順-粘康酸
[0026]大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 接種裝有 500mL種子培養基的500mL搖瓶中，該培養基的pH為7.0，含有下述質量百分比的組分:葡萄糖2%，蛋白胨l%，NaCl 0.5%，在37°C、220r/min的搖床培養16小時后，把500mL培養液接種有5000mL發酵培養基7.5L發酵罐(NBS BioFlo?115)中，該培養基含有下述質量百分比的組分:葡萄糖 15%，NH4Cl 1.5%, NaCl 0.5%, Na2HPO4 0.3%, KH2PO4 0.1%, MgSO4.7H20
0.05%, CaCl 0.01%，莽草酸0.006%。，通過5M的NaOH實時控制pH為7左右。在35°C，通氣量為1:1的條件下發酵84小時后，離心分離菌體，按常規方法測定上清液中含有丙酮酸為52g/l。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]附圖1:根據Klebsiella pneumoniae A170-40的3_脫氫莽草酸脫水酶基因密碼子優化的新基因aroZ-jCat序列
[0028]附圖2:根據Klebsiella pneumoniae A170-40的原兒茶酸脫羧酶基因密碼子優化的新基因aroY-jCat序列
[0029]附圖3:根據Acinetobacter calcoaceticus的兒茶酌.I, 2_雙氧化酶基因密碼子優化的新基因catA-jCat序列
[0030]附圖4:3_脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1，2-雙氧化酶組成的異源表達模塊CCMA示意圖
[0031]附圖5:3_脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1，2-雙氧化酶組成的異源表達模塊CCMA序列
[0032]附圖6:重組質粒pAC`YC-CCMA圖譜
【權利要求】
1.一株能夠發酵生產順，順-粘康酸的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340CGMCC No 6435。
2.根據權利I要求，菌的含有經過密碼子優化的附圖3-脫氫莽草酸脫水酶基因aroZ-jCat，原兒茶酸脫羧酶基因aroY-jCat和兒茶酚1，2_雙氧化酶基因catA-jCat及人工設計的組成型啟動子P3和終止子Tl。
3.根據權利I要求，菌的生長及發酵生產的培養基包括碳源、氮源、無機鹽和莽草酸，pH6.5-7.5。
4.根據權利要求3所述，其特征在于:所述碳源為質量百分含量為1%-20%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物質水解糖液。
5.根據權利要求3所述，其特征在于:所述氮源為質量百分含量為0.1% -3%的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆餅粉和/或花生柏和/或銨鹽和/或硝酸鹽和/或尿素。
6.根據權利要求3所述，其特征在于:所述無機鹽包括質量百分含量為0.1% -0.8%的 Na2HPO4 和 / 或 0.05-0.5 % 的 KH2PO4 和 / 或 0.01 % -0.1 % 的 NaCl 和 / 或 0.005 % -0.1%的 MgSO4 和 / 或 0.005-0.05% 的 CaCl2。
7.根據權利要求3所述，其特征在于:所述莽草酸添加的范圍是質量百分含量0.001% -0.008%。
8.根據權利要求1、2、3、4、5、6或7所述,其特征在于:大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的生長和發酵溫度為 30_40°C。
9.根據權利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述,其特征在于:大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的發酵時間為 16 小時-120 小時。
10.根據權利要求1所述的菌株在順，順-粘康酸生產中的應用。
11.根據權利要求2、3、4、5、6、7、8或9所述的配方和方法在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 順，順-粘康酸的生產中的應用。
【文檔編號】C12R1/19GK103667166SQ201210362308
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月21日 優先權日:2012年9月21日
【發明者】王欽宏, 吳元慶, 陳五九, 張媛媛, 彭彥峰, 元飛, 馬延和 申請人:天津工業生物技術研究所