專利名稱：一種阿維菌素菌種選育方法
技術領域：
本發明屬于生物發酵醫藥技術領域，特別是涉及一種阿維菌素菌種選育方法。
背景技術：
阿維菌素是由阿佛曼鏈霉菌生產的一組由十六元大環內酯與一個二齊墩果糖所構成的一類殺蟲抗生素，其在防治農業病蟲害和畜牧業寄生蟲病中有獨特效果，已在我國大量使用，并是我國出口的第二大殺蟲劑品種。目前，在我國阿維菌素菌種育種中，其性能的優劣由搖瓶培養發酵液生產抗生素效價的高低來判定。現有技術中阿維菌素篩選自然選育流程如下選擇出發株、制備分離平 板培養基、制備單孢子懸浮液、涂布分離培養、挑單菌落接斜面、搖瓶初篩(搖瓶培養、HPLC法檢測)、初篩留種、接復篩斜面、搖瓶復篩(搖瓶培養、HPLC法檢測)、復篩留種、性狀考察和高產菌種復篩留種。上述方法存在著流程繁瑣、選育周期長、工作量大、需要專用設備(恒溫振蕩器)、能耗大、成本高、篩選效率低等缺陷。因此，在實際生產中，本著“初篩以量為主、復篩以質為主”的篩選原則，盡可能地放大初篩數量，使初篩的手段盡可能地快速、簡單；但現行工藝從單菌落培養到菌種性能的初篩檢測還是需35天左右，緩慢又繁瑣；并且，在此期間菌種培養恒溫室、搖瓶培養恒溫振蕩器均處于在線使用狀態，設備及功能間的利用率低、菌選耗時長，對于阿維菌素菌種選育工作來說，篩選工作依然處于低效率狀態。因此，提供一種快速初篩方法對于阿維菌素的生產來說具有非常重要的意義。抑菌圈測定抗生素效價方法是傳統的快速初篩測定法。其原理是待篩選的菌株能分泌產生某些能抑制試驗菌生長的物質，或能分泌某種酶并將無毒的物質水解成對試驗菌有毒的物質，從而在該菌落周圍形成試驗菌不能生長的抑菌圈。方法是將待檢測菌種的單菌落瓊脂塊移至含有試驗菌(多采用短小芽孢桿菌)的瓊脂塊培養基上，在適宜溫濕度下培養一段時間后取出，用游標卡尺來分別測定各抑菌圈的直徑，直徑大小反映了瓊脂塊產抗生素能力的大小，以此判斷、擇優選取。由于阿維菌素沒有抑菌活性，其自身不能分泌抑制試驗菌生長的物質或分泌某種對試驗菌有毒的物質，當其轉入含試驗菌的培養基上就會被試驗菌所抑制甚至殺滅，所以阿維菌素菌選過程中效價的檢測不能采用抑菌圈法。
發明內容
本發明目的在于提供一種有效縮短阿維菌素菌種選育周期，提高篩選效率，降低篩選成本的菌種選育方法。本發明采用瓊脂塊培養初篩流程選育法，過程為生產菌種斜面培養，制備單孢子懸浮液，涂布分離培養出單菌落，同時進行挑取單菌落點種于固體培養基平板上及挑單菌落進行斜面培養，待點種菌落培養成熟后，用HPLC法檢測產素能力作為初篩效價，挑取與初篩效價高的斜面菌落搖瓶復篩，復篩搖瓶效價HPLC法檢測，高產菌株復篩留種，高產菌株性能考察，最終留種。上述工藝具體來說為挑選生產使用的阿維菌素斜面一瓶，制備成單孢子懸浮液，梯度稀釋后按一定體積注入分離培養基中，涂步均勻，按照菌種工藝培養至5 7天(菌落成型、表面有孢子分泌)，用滅菌牙簽選取各型單菌落(菌落形態要有記錄)點種于點種優化培養基上，點種培養平皿倒置于恒溫培養室培養10 12天，培養溫度28± 1°C ;分離平皿倒置于恒溫培養室繼續培養2天左右，認真觀察菌落的生長變化。待分離培養基上單菌落生長成熟，挑取單菌落制備斜面；待點種培養基上單菌落生長成熟，用接種鏟鏟下單菌落、用適宜溶劑提取后經HPLC做初篩檢測；待斜面生長成熟，鏟下并用適宜溶劑提取后經HPLC做初篩檢測。在試驗過程中認真觀察各階段菌株的生長情況、統計HPLC檢測結果、分析各數據統計表之間的相關性，得到以下發明效果本發明可以有效縮短阿維菌素的選育周期、提高篩選效率、節約篩選成本；瓊脂塊培養初篩法得到的菌種性能與相應的增殖斜面得到的驗證結果能有效對應。本發明的效果與傳統的阿維菌素搖瓶初篩選育方法相比，本發明可以將篩選周期縮短近半個月，并且瓊脂塊培養初篩法得到的菌種性能與相應的增殖斜面得到的驗證結果能有效對應。
具體實施方式
I、儀器與材料I. I 儀器漩渦混合器、臺式低速離心機、安捷倫高效液相色譜儀。I. 2 材料:出發菌株(挑選生產使用菌株阿佛曼鏈霉菌Streptomyces avermitilis,),分離(斜面)培養基、點種培養基、種子搖瓶培養基、發酵搖瓶培養基；丙酮(分析純)、甲醇(分析純)、無水甲醇(色譜純)，有機濾膜。I. 2. I 培養基I. 2. I. I分離(斜面)培養基(g / L):可溶性淀粉10、(NH4)2S042. 5,NaCLO. 6,MgSO4. 7H201. 2,K2HPO4. 3H203. 0、CaC033.0、瓊脂粉20;PH7. 2 7. 4，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。I. 2. I. 2 點種培養基(g / L)1#---可溶性淀粉 10、(NH4)2S042. 5,NaCLO. 6、MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203.0、CaC033. 0、瓊脂粉 20;PH7. 2 7. 4，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。2#玉米淀粉70、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏4. 0、CaC033.0、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、瓊脂粉 20;PH7. O 7. 2，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。3#玉米淀粉70、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏3. O、玉米漿 2. 2、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、瓊脂粉 20;PH7. O 7. 2，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。4#玉米淀粉25、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏5. O、玉米漿 4. 0、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、瓊脂粉 20;
PH7. O 7. 2，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。I. 2. I. 3搖瓶種子培養基(g / L):玉米淀粉25、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏5. O、玉米漿4. O、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025 ；PH7. O 7. 2，用自來水配制，121°C滅菌30min。I. 2. I. 4搖瓶發酵培養基(g / L):玉米淀粉70、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏3. O、玉米漿2. 2、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025 ；PH7. O 7. 2，用自來水配制，121°C滅菌30min。
2、方法2. I培養方法2. I. I分離平皿的制備挑選大生產使用的生長飽滿的工作細胞庫斜面，加入15ml無菌水，用接種環刮取孢子，將其懸浮在無菌水中，制成混合均勻的孢子懸浮液。用滅菌的濾紙進行過濾，收集過濾孢子液，并進行10-1 10-6梯度稀釋，取10-5、10-6稀釋液O. I O. 15ml注入于分離培養基平板上，用三角耙耙勻，倒置于恒溫培養室28±1°C培養7 9天。2. I. 2點種平皿的制備取培養至第5 7天的上述分離平板，用肉眼篩選出飽滿、均勻、分泌孢子量大、形態規整或經驗型產抗能力差的單菌落，在背面標記序號；并在點種培養基背面標記相應的序號(I個分離單菌落對應2個點種菌落序號；分別用3-1、3-2標示)，用滅菌過的牙簽輕輕點種于相應序號位置標記處的點種培養基上，點種培養平皿倒置于恒溫培養室28± 1°C培養10 12天；分離平皿倒置于恒溫培養室28± 1°C繼續培養2天左右，認真觀察菌落的生長變化。2. I. 3斜面制備用點種肉眼篩選方法選取優質單菌落和點種后帶序號的單菌落，用接種環挑取單菌落接種于斜面培養基上，倒置于恒溫培養室28土 1°C培養7 9天。2. I. 4種子搖瓶將培養好的斜面菌種用接種鏟鏟取I. 0cm*I. Ocm接種于種子搖瓶培養基中，28±l°C、220r / min振蕩培養25 30hr，觀察其菌絲生長情況。2. I. 5發酵搖瓶將培養成熟的種子液按10%的接種量轉接于發酵搖瓶中，28±l°C、220r / min振蕩培養10天。2. 2 初篩:2.2.1液體搖瓶復篩取2. I. 5培養好的發酵液IOml于離心管中，3000r / min離心IOmin,棄去上清液。加入丙酮IOml,在鏇潤混合器上振蕩提取5min,靜置IOmin,再經3000r / min離心IOmin,得萃取液，經O. 45u有機濾膜過濾，準確吸取5. Oul樣品濾液進樣，利用自動高效液相色譜儀檢測菌株的生產能力。2. 2. 2瓊脂塊培養初篩
分別將2塊2. I. 2培養好的、同序號點種單菌落鏟下置于同一離心管中，加IOml分析純甲醇，在鏇潤混合器上充分振蕩3min提取，4000r / min離心lOmin、靜置IOmin后，經O. 45u有機濾膜過濾，準確吸取5. Oul樣品濾液進樣，利用自動高效液相色譜儀檢測菌株的生產能力。3、結果與分析3. I 結果3.1.1點種培養基優化試驗結果見表I點種培養基設計見I. 2. I. 2。點種菌落生長情況如下表I
權利要求
1.一種阿維菌素菌種選育方法，其特征在于采用瓊脂塊培養法。
2.按照權利要求I所述的阿維菌素菌種選育方法，其具體步驟為生產菌種斜面培養，制備單孢子懸浮液，涂布分離培養出單菌落，同時進行挑取單菌落點種于固體培養基平板上及挑單菌落進行斜面培養，待點種菌落培養成熟后，用HPLC法檢測產素能力作為初篩效價，挑取與初篩效價高的斜面菌落搖瓶復篩，復篩搖瓶效價HPLC法檢測，高產菌株復篩留種，聞廣菌株性能考察，最終留種。
3.按照權利要求2所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于上述挑取單菌點種于固體培養基平板上時每個單菌落點種兩塊。
4.按照權利要求2所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于上述單菌落點種和單菌落斜面培養是在在28土 1°C條件下培養7 9天。
5.按照權利要求2所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于上述涂布分離培養是在28±1°C條件下培養10 12天。
6.按照權利要求2所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于上述HPLC法檢測產素能力是指點種固體培養基平板培養結束后，將源于同一單菌落的兩塊瓊脂塊取下置于同一離心管中，加適量甲醇，充分震蕩混合，轉速4000rpm離心lOmin、靜置后，經O. 45um有機濾膜過濾，收集過濾液，用HPLC法測定單菌落的產素能力。
7.按照權利要求1、2、3、4或5所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于用于分離培養、點種培養和斜面培養所用的培養基為瓊脂塊固體培養基。
全文摘要
本發明涉及一種阿維菌素菌種選育方法，采用瓊脂塊培養法進行初篩，即生產菌種斜面培養，制備單孢子懸浮液，涂布分離培養出單菌落，同時進行挑取單菌落點種于固體培養基平板上及挑單菌落進行斜面培養，待點種菌落培養成熟后，用HPLC法檢測產素能力作為初篩效價，挑取與初篩效價高的斜面菌落搖瓶復篩，復篩搖瓶效價HPLC法檢測，高產菌株復篩留種，高產菌株性能考察，最終留種。本發明可以有效縮短阿維菌素的選育周期、提高篩選效率、節約篩選成本。與傳統的阿維菌素搖瓶初篩選育方法相比，本發明可以將篩選周期縮短近半個月，并且瓊脂塊培養初篩法得到的菌種性能與相應的增殖斜面得到的驗證結果能有效對應。
文檔編號C12N1/20GK102839143SQ20121036061
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者李學兵, 崔莉, 張燕玉 申請人:寧夏啟元藥業有限公司