專利名稱：一種用于結直腸癌大量篩查的生物標記物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種結直腸癌篩查的技術領域，具體涉及一種用于結直腸癌大量篩查的生物標記物，即通過對DNA樣品中該生物標記物的甲基化狀態進行檢測以確定罹患結直腸癌的可能性。
背景技術：
結直腸癌是世界最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均居惡性腫瘤的第三位，且呈上升趨勢。北美和西歐國家結直腸癌發病率分別達44. 4/10萬和42. 9/10 萬，我國也已達13. 29/10萬。結直腸癌一般會經歷7 10年的從正常粘膜組織、腺瘤、再到惡性腫瘤的演變過程。結直腸癌的早期治愈率可達90%，但晚期治愈率僅為5%。因此，早期篩查和手術切除腺瘤或早期惡性腫瘤對降低結直腸癌的死亡率意義重大。
結直腸癌傳統的篩查方法包括糞便潛血試驗、糞便免疫試驗、結腸鋇劑灌腸檢查、 乙狀結腸鏡檢查及結腸鏡檢查。其中，糞便潛血試驗和糞便免疫試驗具有一定的特異性和靈敏性，但前提是患者已存在明顯的腫瘤大小，因此不適用于結直腸癌的早期檢測。內窺鏡檢查是目前結直腸癌篩查的最好方法，但由于這種方法侵入性、費用高、風險大、易產生并發癥等缺陷限制了其在普查篩選中的應用。因此需要尋找一種方便、經濟、無創，且具有較高檢出率的方法用于結直腸癌的大規模篩查。
最近研究發現DNA甲基化狀態改變與癌癥的發生發展關系密切。DNA甲基化主要出現在基因啟動子區域的CpG島中的胞嘧啶，通過阻礙轉錄因子的結合從而導致基因表達沉默。已經發現在許多癌癥中都存在抑癌基因、DNA修復基因、細胞周期調節基因的高甲基化。因此腫瘤相關基因的甲基化是癌癥的重要指標，可作為結直腸癌的早期檢測與診斷的生物標記物。
隨著對結直腸癌研究的深入，發現許多抑癌基因、致癌基因和細胞信號轉導通路參與了腸上皮細胞的癌轉化以及腫瘤發展，其中Wnt信號通路的調控作用尤為重要。Wnt的途徑激活涉及Wnt蛋白與細胞表面受體Frizzled和聯合受體LRP5/6的結合，并導致APC/ Axin/CKla/GSK3 β復合物解體，促進β-catenin入核,從而激活下游祀基因表達。研究發現，Wnt信號通路的異常激活在結直腸癌發生發展中起重要作用。Wnt信號通路的兩個重要成員APC或β -catenin在80 90%的結直腸癌患中發生了突變。
結直腸癌中Wnt信號通路可受多種機制調控，如通路成員的突變、表觀遺傳沉默基因表達、配體激活和拮抗基因的抑制等。目前發現多種能調控Wnt信號通路的蛋白，包括SFRP蛋白家族、WIFUWise和DKK蛋白家族等。R-spondin (RSPO)是近年來發現能夠調控Wnt信號通路的一個新蛋白家族。RSPO家族由4個富含半胱氨酸的分泌蛋白組成，即 RSP01、RSP02、RSP03和RSP04。RSPO家族蛋白參與了多種生物學進程，如細胞增殖，胚胎發育，骨骼形成，肌肉細胞分化，腫瘤的發生等。
R-spondin2 (RSP02)是RSPO家庭成員之一，其具有多種生物學功能。RSP02基因位點與人類Dupuytren疾病的遺傳易感性相關。RSP02通過調節Wnt信號通路影響狗毛的樣式。RSP02同時是脊椎動物胚胎發育的關鍵基因，RSP02基因敲除小鼠在出生后立即死亡，并攜帶多種生理缺陷，如肢體發育不全，顱面和喉氣管畸形，肺發育不良。最近研究發現 RSP02與癌癥的發生相關。一項研究表明，RSP02可以影響乳腺上皮細胞的生長和促進腫瘤轉移。在結直腸癌中，FOXQl基因的過表達顯著改變RSP02的表達。已經發現RSP02的 mRNA和蛋白表達在結直腸癌細胞及組織中明顯下調。進一步研究發現，腸癌細胞的RSP02 甲基化水平顯著高于對照細胞。對臨床樣品檢測也發現RS0P2的甲基化程度與結直腸癌高度相關。因此，RSP02甲基化可作為結直腸癌早期檢測或篩查的有用標記。
目前，現有技術雖然存在對DNA基因甲基化的檢測方法但并沒有具體對RSP02基因進行甲基化的檢測方法進行研究。發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，本發明提供了一種用于結直腸癌大量篩查的生物標記物，可以通過該生物標記物篩查人類患結直腸癌的可能性；本發明的另一目的在于提供了一種RSP02基因甲基化的MSP檢測方法，實現了 RSP02基因的甲基化檢測。
為了實現上述目的，本發明采用了以下的技術方案一種用于結直腸癌大量篩查的生物標記物，所述的生物標記物為RSP02基因。
作為優選，用MSP檢測結直腸癌細胞中RSP02甲基化狀態時使用的引物對為對 RSP02甲基化狀態有特異性的上游引物RSP02-M1和下游引物RSP02-M2，引物對的序列如下
權利要求
1.一種用于結直腸癌大量篩查的生物標記物，其特征在于所述的生物標記物為 RSP02基因。
2.根據權利要求I所述的用于結直腸癌大量篩查的生物標記物，其特征在于用MSP 檢測結直腸癌細胞中RSP02甲基化狀態時使用的對RSP02甲基化狀態有特異性的上游引物 RSP02-M1和下游引物RSP02-M2，引物對的序列如下引物名稱引物序列RSP02-M1TTGTATTTTTATCGGAAAGTGCRSP02-M2ATATCGCTTCCTACGCTTTC
3.根據權利要求I或2所述的用于結直腸癌大量篩查的生物標記物，其特征在于所述的包含RSP02基因的基因組DNA來源于結直腸癌細胞。
4.一種RSP02基因甲基化的MSP檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)提取包含RSP02基因的基因組DNA，用分光光度計檢測DNA純度與含量；(2)對提取的包含RSP02基因的基因組DNA用亞硫酸氫鈉進行處理修飾；(3)以步驟(2)中處理修飾后的DNA為模板，設計RSP02甲基化特異性引物，取RSP02 甲基化特異性引物、DNA聚合酶、PCR反應緩存液、dNTP、去離子水混合，進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性3 min, 940C 30 S、退火45 s、72°C 40 s共37個循環， 72°C延伸 10 min ；(4)PCR反應結束后，取PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；(5)對檢測結果進行分析，對RSP02甲基化的特異性引物擴增出139bp條帶的PCR產物為甲基化陽性，即存在RSP02甲基化。
5.根據權利要求4所述的RSP02基因甲基化的MSP檢測方法，其特征在于所述的步驟(3)中的RSP02甲基化特異性引物對的序列如下引物名稱引物序列RSP02-M1TTGTATTTTTATCGGAAAGTGCRSP02-M2ATATCGCTTCCTACGCTTTC
6.根據權利要求4所述的RSP02基因甲基化的MSP檢測方法，其特征在于所述的包含RSP02基因的基因組DNA來源于糞便。
全文摘要
本發明公開了一種用于結直腸癌大量篩查的生物標記物，為RSPO2基因。本發明還公開了一種RSPO2基因甲基化的MSP檢測方法，包括以下步驟提取包含RSPO2基因的基因組DNA，檢測其純度與含量；用亞硫酸氫鈉進行處理修飾；以步驟處理修飾后的DNA為模板，設計RSPO2甲基化特異性引物，進行PCR擴增，結束后，取PCR產物電泳檢測；分析結果，對RSPO2甲基化的特異性引物擴增出139bp條帶的PCR產物為甲基化陽性，即存在RSPO2甲基化。本發明利用RSPO2作為結直腸癌大量篩查的生物標記物，并且提供了RSPO2甲基化狀態檢測方法，可檢測患者是否患有結直腸癌，具有非侵入性、樣品收集方便靈活等特點。
文檔編號C12N15/12GK102936597SQ20121035630
公開日2013年2月20日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者魯新成, 路立婷, 廖婉琴, 武長杰, 邱孫全 申請人:溫州醫學院