專利名稱：Stc細(xì)胞生產(chǎn)高效豬偽狂犬病活疫苗工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬偽狂犬病是威脅養(yǎng)豬業(yè)的兩大傳染病之一，我國(guó)主要通過(guò)預(yù)防接種偽狂犬活疫 苗來(lái)控制該病。目前國(guó)內(nèi)各獸用生物制品企業(yè)生產(chǎn)豬偽狂犬病活疫苗均采用雞胚成纖維原 代細(xì)胞。而雞胚成纖維原代細(xì)胞往往采用水解乳蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)，水解乳蛋白中含有很多 未知的動(dòng)物蛋白成分，在臨床應(yīng)用中有很多過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生。另外，雞胚成纖維細(xì)胞繁殖的偽 狂犬病毒含量多在106_°TCID5(i/0. lml左右。國(guó)外已采用豬睪丸(ST)傳代細(xì)胞生產(chǎn)豬偽狂 犬病活疫苗，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有生物制品企業(yè)采用傳代細(xì)胞生產(chǎn)豬偽狂犬病活疫苗。ST細(xì)胞對(duì)培 養(yǎng)基和牛血清要求比較嚴(yán)格，所以培養(yǎng)比較困難。很多科研機(jī)構(gòu)都在篩選適應(yīng)于病毒株的 細(xì)胞株，以用于科研或生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
將ST細(xì)胞進(jìn)行多次克隆，最后篩選了 STC細(xì)胞克隆株。該細(xì)胞株易于培養(yǎng)，且對(duì) 豬偽狂犬病毒(Batha K/61gI_株)高度敏感，用于生產(chǎn)高效豬偽狂犬病活疫苗。
圖1 ST (A)、STC (B)培養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞形態(tài)圖2 PRV接種ST (A)和STC (B)細(xì)胞后24小時(shí)細(xì)胞病變圖3 ST細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖4 PRV在克隆STC細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖5 STC細(xì)胞外源病毒檢測(cè)結(jié)果M :標(biāo)準(zhǔn)分子且 2000bp DNA Ladder ;Lane 2\4\6\8 :STC 克隆細(xì)胞；Lanel :DNA 病毒PCV1 PCR產(chǎn)物，分子量大小413bp ；Lane3 RNA病毒BVDV RT-PCR產(chǎn)物，分子量大小 290bp ；Lane5 :RNA 病毒 EMCV RT-PCR 產(chǎn)物，分子量大小 186bp ；Lane7 :RNA 病毒 HCV RT-PCR 產(chǎn)物，分子量大小375bp ；Lane 9 :陰性對(duì)照。圖6支原體檢驗(yàn)結(jié)果(A :支原體陽(yáng)性對(duì)照
具體實(shí)施例方式1.對(duì)PRV Batha K/61gI_株敏感的ST細(xì)胞系的篩選1) ST母細(xì)胞的連續(xù)有限稀釋將保存的ST母細(xì)胞株稀釋成單個(gè)細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞 板，10天左右觀察孔內(nèi)細(xì)胞克隆數(shù)，將單個(gè)克隆繼續(xù)稀釋成單個(gè)細(xì)胞，即亞克隆，經(jīng)三次亞 克隆后，挑單克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并接毒、觀察細(xì)胞病變，檢測(cè)其對(duì)PRV Batha K/61gI_株的易感性如何，將篩選得到的PRV Batha K/61g1-株易感的ST細(xì)胞株命名為STC。2)用測(cè)定TCID5tl方法對(duì)ST的單克隆株進(jìn)行篩選將ST細(xì)胞克隆株接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層接種PRV Batha K/61g1-株(實(shí)驗(yàn)室保存)，于36. 5°C 37. 5°C 3% 5% CO2培養(yǎng)72h，觀察細(xì)胞病變，計(jì)算TCID5tl。3)高滴度PRV Batha K/61gI_株培養(yǎng)細(xì)胞ST克隆株的獲得挑選TCID5tl最高的ST細(xì)胞克隆株進(jìn)行傳代并冷凍保存。2. ST細(xì)胞系的特性研究2.1細(xì)胞形態(tài)研究分別取等量的ST母細(xì)胞、克隆株STC細(xì)胞接種于6孔板中，24h后待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層觀察其形態(tài)差異(圖1，A和B);分別于兩株細(xì)胞接種等量病毒(100TCID5(l/ml)，接種后于24h (圖2，A和B)觀察細(xì)胞病變。2. 2細(xì)胞生長(zhǎng)速度研究取約I X IO5個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，分別于第8、16、24、32、48、56、64和72小時(shí)取其中I孔細(xì)胞進(jìn)行染色、計(jì)數(shù)，每個(gè)孔做3個(gè)重復(fù)，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。表I細(xì)胞生長(zhǎng)速度(個(gè)/ml)
權(quán)利要求
1.STC細(xì)胞的特點(diǎn)及用途 ST細(xì)胞為豬睪丸細(xì)胞，體外培養(yǎng)呈貼壁生長(zhǎng)、并可進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。ST細(xì)胞培養(yǎng)比較困難，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高?？寺〉腟TC細(xì)胞株易于培養(yǎng)。PRV可在STC細(xì)胞上繁殖，產(chǎn)生CPE,因此可用于生產(chǎn)豬偽狂犬病活疫苗。
2.根據(jù)I所述的STC細(xì)胞克隆株，是通過(guò)以下方法獲得的 DST母細(xì)胞的連續(xù)有限稀釋將保存的ST母細(xì)胞株稀釋成單個(gè)細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞板，10天左右觀察孔內(nèi)細(xì)胞克隆數(shù)，將單個(gè)克隆繼續(xù)稀釋成單個(gè)細(xì)胞，即亞克隆，經(jīng)三次亞克隆后，挑單克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并接毒、觀察細(xì)胞病變，檢測(cè)其對(duì)PRV Batha K/61gl_株的易感性如何，將篩選得到的PRV Batha K/61 gl_株易感的ST細(xì)胞株命名為STC ; 2)用測(cè)定TCID50方法對(duì)ST的單克隆株進(jìn)行篩選將ST細(xì)胞單克隆株接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層接種PRV BathaK/61 gl_株(實(shí)驗(yàn)室保存)，于36. 5°C 37. 5°C 3% 5% C02培養(yǎng)72h，觀察細(xì)胞病變，計(jì)算TCID50 ； 3)高滴度PRVBatha K/61 gl_株培養(yǎng)細(xì)胞ST克隆株的獲得挑選TCID50最高的ST細(xì)胞克隆株進(jìn)行傳代并冷凍保存。
3.對(duì)1、2中篩選保存的STC細(xì)胞的特性進(jìn)行鑒定 鑒定內(nèi)容包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、對(duì)PRV Batha K/61 gl_株敏感性的穩(wěn)定性檢測(cè)、TCID50測(cè)定、病毒生長(zhǎng)曲線及外源微生物的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。STC細(xì)胞生產(chǎn)高效豬偽狂犬病活疫苗工藝的研究包括高滴度偽狂犬病毒(Batha K/61 gI-株)敏感的ST培養(yǎng)細(xì)胞克隆株的建立、篩選和鑒定。為獲得能穩(wěn)定且產(chǎn)生高滴度偽狂犬病毒(Batha K/61 gI-株的ST細(xì)胞系，對(duì)ST母細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋后進(jìn)行了連續(xù)的細(xì)胞克隆，獲得1株對(duì)PRV具有高敏感性的STC細(xì)胞系。接種100TCID50/ml PRV，測(cè)定STC和ST細(xì)胞繁殖的PRV病毒滴度分別為108.5TCID50、107.0TCID50，并且PRV病毒在STC細(xì)胞中產(chǎn)生和積累的速度要快于ST母細(xì)胞，從而表明STC細(xì)胞系對(duì)PRV更為敏感，可用于生產(chǎn)高效豬偽狂犬病活疫苗。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103060262SQ20121035173
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者尹秀鳳, 陳念劬, 徐凱 申請(qǐng)人:南京天邦生物科技有限公司