一種毛發狀親水聚合物雜化磁性顆粒固定化蛋白酶及其制備方法

一種毛發狀親水聚合物雜化磁性顆粒固定化蛋白酶及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶及其制備方法。該固定化酶的制備方法如下：通過SI-ATRP法在磁性顆粒表面原位聚合生成聚甲基丙烯酰胺葡萄糖聚合物鏈，并利用氧化開環聚合物側鏈葡萄糖生成醛基，之后與蛋白酶N端氨基共價偶聯的方法進行蛋白酶固定。酶解產物和固定化酶可通過外加磁場分離。該固定化酶與蛋白質樣本混合后，僅需在37℃條件下孵育1-2分鐘即可完成蛋白質酶解，大大縮短了酶解時間。同時解決了現有疏水性固定化酶材料對蛋白質及其酶解產物的非特異性吸附的問題，提高了樣品回收率。最后，該固定化酶使用簡便、快捷，穩定性好，可多次重復使用，在大規模蛋白質組樣本分析中具有很好的應用前景。
【專利說明】一種毛發狀親水聚合物雜化磁性顆粒固定化蛋白酶及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種毛發狀親水聚合物雜化磁性顆粒固定化蛋白酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002]作為后基因組時代的重點研究領域，蛋白質組學研究不僅能為生命活動規律的闡明提供理論基礎，也能為眾多種疾病的早期診斷、藥靶的發現、療效判斷和預后提供了重要依據。自2001年被“科學”雜志評為21世紀的六大熱點研究領域后，蛋白質組學研究受到了科學家的廣泛關注。目前，基于“鳥槍法”的蛋白質組鑒定策略是應用最為廣泛和成功的復雜蛋白質組樣品的定性、定量研究策略。這一策略依賴于蛋白酶對蛋白質的位點特異性酶解反應，從而將蛋白質酶解為與質譜鑒定更為兼容的多肽，通過對多肽的質譜分析，獲得相應的蛋白質的定性和定量信息。因此蛋白質的酶解效率和完全性是蛋白質組研究中樣品制備過程中的關鍵步驟，對最終鑒定結果的可靠性和準確性有著至關重要的影響。傳統的溶液酶解方法為了避免蛋白酶自切，往往使用較低的蛋白酶比例(蛋白酶:底物=I: 50)，因此需要較長的孵育時間(12-20小時)，限制了樣本的分析通量和酶解完全性，無法滿足蛋白組學大規模、高通量定性和高準確度定量分析的要求。
[0003]基于以上原因，發展快速、高效的蛋白質酶解技術，對于復雜蛋白質組樣品的分析是十分必要的。固定化酶技術避免了傳統溶液酶解中普遍存在的酶自切的問題，因此可使用的酶濃度獲得了提高，加快了酶解反應的進程，而且具有可回收并重復使用等諸多優點。在眾多的固定化酶載體材料，如聚合物膜，整體柱材料，多孔材料中(Xu，F.et al.Anal.Chem.2010,82,10045-10051.Spross, J.et al.Anal.Chem.2010,82,1434-1443.Qian, K.etal.Anal.Chem.2009，81，5749-5756.)，磁性納米顆粒因為其較大的比表面積以及易于實現磁性分離等特性凸顯優勢(Lin，S.et al.J.Proteome Res.2008, 7,1297-1307.)。但目前普遍采用的在基體材料表面直接進行單層酶固定的方法，使單位質量固定化酶材料的酶固載量受到基體材料表面積的限制，因而限制了酶解效率的進一步提高。同時，常用的硅或疏水聚合物基體材料難以避免對蛋白質及其酶解產物產生非特異性吸附，導致樣品損失，從而影響蛋白質鑒定的靈敏度和定量的`準確度。
[0004]原子轉移自由基聚合法(AtomTransfer Radical Polymerization, ATRP)是Matyjaszewki K.教授小組于1995年首次提出的一種可控自由基聚合方法。十余年以來得到了國際學術界和工業界的廣泛關注。ATRP方法具有產物聚合物結構可控性好、分子量分布窄、適用單體范圍廣、反應條件要求適中等特點。表面引發原子轉移自由基聚合法(S1-ATRP)是將ATRP引發劑固定于材料表面后原位引發聚合物生長的一種方法，現已廣泛應用于材料的表面修飾與功能化。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶及其制備方法。
[0006]本發明所提供的毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶是按照包括下述步驟的方法制備得到的:
[0007]I)合成一種一端為能與二氧化硅包裹磁性納米顆粒結合的硅烷偶聯劑、另一端為原子轉移自由基聚合(ATRP)引發劑的表面引發原子轉移自由基聚合(S1-ATRP)引發劑；
[0008]2)使所述S1-ATRP引發劑中的硅烷偶聯劑與二氧化硅包裹的磁性納米顆粒表面的硅羥基反應，從而將S1-ATRP引發劑共價連接于所述二氧化硅包裹的磁性納米顆粒表面；
[0009]3)在單體和催化劑體系存在下，于步驟2)得到的二氧化硅包裹的磁性納米顆粒表面引發原子轉移自由基聚合反應，在其表面原位生成毛發狀聚合物鏈；其中，所述單體為能用于原子轉移自由基聚合的單體，且在所述單體中含有能與待固定化的酶反應的官能團或在所述單體中含有經化學修飾后能與待固定化的酶反應的官能團；
[0010]4)分為下述a)或b):
[0011]a)步驟3)中所述單體中含有能與待固定化的酶反應的官能團，使步驟3)中所述聚合物鏈上的官能團與待固定化的酶反應，將酶連接到所述聚合物鏈上，再將所述聚合物鏈上未與酶反應的官能團封閉，得到所述聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶；
[0012]b)步驟3)中所述單體中含有經化學修飾后能與待固定化的酶反應的官能團，將步驟3)中所述聚合物鏈上的官能團進行化學修飾，使其轉變為能與待固定化的酶反應的官能團，然后再與待固定化的酶反應，將酶連接到所述聚合物鏈上，再將所述聚合物鏈上未與酶反應的官能團封閉，得到所述聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶。
[0013]其中，步驟I)中所述S1-ATRP引發劑具體可由3-氨基丙基三乙氧基硅烷(硅烷偶聯劑)與2-溴異丁酰溴(ATRP引發劑)通過氨基與酰溴反應生成酰胺鍵得到。并通過S1-ATRP引發劑中的硅烷偶聯劑與包裹了二氧化硅的磁性顆粒表面的硅羥基發生脫水反應生成硅氧鍵，從而將S1-ATRP引發劑共價鍵合到磁性顆粒表面。
[0014] 步驟2)中所述磁性納米顆粒具體可為四氧化三鐵磁性納米顆粒，其粒徑可為20nm,經二氧化娃包裹后粒徑為57.4nm。
[0015]步驟3)中所述單體優選為親水性單體，具體可為:甲基丙烯酰胺葡萄糖(GMA-G)、丙烯酸類單體、丁烯酸類單體或戊烯酸類單體等。所述GMA-G單體是由甲基丙烯酸縮水甘油酯被氧化生成醛基后和氨基葡萄糖上的氨基反應獲得的。當采用GMA-G單體制備聚合物鏈時，制備完成后需將親水聚合物側鏈上的葡萄糖中的鄰二醇結構氧化為醛基，然后與待固定化的酶反應(當連接的酶為胰蛋白時，是利用醛基與蛋白酶的N-端和側鏈氨基反應)，將酶連接到所述聚合物鏈上，再將聚合物鏈上剩余的醛基用氨基乙醇封閉。
[0016]步驟3)中所述催化劑體系由催化劑和配體組成。所述催化劑選自下述任意一種金屬的鹵化物:Cu、Mo (IV)、Ru、Rh、Fe、Re、N1、Pd和pb ;優選氯化亞銅。
[0017]所述配體選自下述任意一種:1，1，4，7，7-五甲基二亞乙基三胺、聯吡啶、四甲基乙二胺、1，1，4，7，10，10_六甲基三亞乙基四胺和三(N，N—二甲基氨基乙基)胺。所述單體、催化劑、配體的摩爾比可為200: (0.5-5): (0.75-7.5)。
[0018]在步驟3)中，單體加入量相對于表面連接S1-ATRP引發劑的磁性納米顆粒是過量的。以GMA-G單體為例，GMA-G單體與磁性納米顆粒的配比可為2mmol: 50mg。[0019]本發明中用于固定化的酶包括各種蛋白酶，如胰蛋白酶、蛋白內切酶(Glu-C)、胞內蛋白酶(Lys-c)等；及糖苷酶,如肽N-糖苷酶F(PNGase F)等。
[0020]本發明所提供的親水聚合物雜化磁性顆粒固定化酶可用于蛋白質的快速酶解。僅需將變性的蛋白質樣品與親水聚合物雜化磁性顆粒固定化酶溶解于50mM碳酸氫銨(pH =
8.0)或磷酸鹽(pH = 7.8)緩沖液中并混合均勻，37°C水浴孵育1-2分鐘即可完成酶解。通常使用1-1Omg顆粒固定化酶可對100 μ g蛋白質實現有效酶解。酶解完成后，可使用磁鐵將磁性顆粒固定化酶吸附在管壁上，并吸取上層清液中的酶解產物。簡便、快捷的實現固定化酶與酶解產物的分離，并將固定化酶回收、重復使用。該親水聚合物雜化磁性顆粒固定化酶一般可重復使用50次左右。每次酶解蛋白質后，使用50mM碳酸氫銨(pH = 8.0)將固定化酶清洗3次，去除殘留的肽段。之后將其保存在4°C冰箱中。
[0021]本發明所提供的親水聚合物雜化磁性顆粒固定化酶也可用于蛋白質的高效、完全酶解。以牛血清白蛋白(BSA)為樣本，固定化酶酶解產物中鑒定到的肽段對BSA的序列覆蓋率可達93% ;對復雜蛋白質樣本酶解后，采用SDS-PAGE對酶解產物分析，無明顯蛋白殘
&3甶O
[0022]單一蛋白質酶解反應:以牛血清白蛋白為例。將牛血清白蛋白(BSA)，溶解于50mM碳酸氫銨(pH = 8.0)或磷酸鹽緩沖液(pH = 7.8)中，濃度為0.5mg/ml。加入二硫蘇糖醇(DTT, IOmM)后，再置于沸水中加熱變性lOmin，待冷卻后加入碘乙酰胺(IAA，50mM)，暗處放置lh。將親水聚合物雜化磁性顆粒固定化胰蛋白酶(碳酸氫銨緩沖液)或固定化蛋白質內切酶Glu-C(磷酸鹽緩沖液)加入變性的蛋白質樣品溶液中并混合均勻，37°C水浴孵育I分鐘后，使用磁鐵將磁性顆粒固定化酶吸附在管壁上，并吸取上層清液中的酶解產物。
`[0023]復雜蛋白質樣本酶解反應:以騰沖嗜熱菌全蛋白為例:在騰沖嗜熱菌全蛋白樣本中加入DTT (IOmM)，在37°C水浴中還原4h后，冷卻至室溫，加入IAA (50mM)，暗處放置Ih進行烷基化。將變性的蛋白質樣品與親水聚合物雜化磁性顆粒固定化胰蛋白酶溶解于50mM碳酸氫銨(PH = 8.0)中并混合均勻，37°C水浴孵育2分鐘后，使用磁鐵將磁性顆粒固定化酶吸附在管壁上，并吸取上層清液中的酶解產物。
[0024]將酶解產物點于基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀靶上，加入基質進行質譜分析；或將酶解產物使用液相色譜-電噴霧質譜聯用進行分析。
[0025]以GMA-G為聚合單體，制備毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒固定化胰蛋白酶和固定化蛋白內切酶(Glu-C)為例，對本發明方法的原理進行如下說明:
[0026]如圖1所示，首先將硅烷偶聯劑與ATRP引發劑通過酰胺鍵共價偶聯合成S1-ATRP引發劑。之后通過硅烷偶聯劑與硅羥基反應將S1-ATRP引發劑固定到二氧化硅包裹的磁性納米顆粒表面。之后以丙烯酸縮水甘油酯類試劑與氨基葡萄糖反應生成的親水試劑GMA-G為單體，氯化亞銅為催化劑，1，1，4，7，7-五甲基二亞乙基三胺為配體(按照200: I: 1.5的摩爾比)，與固定了引發劑的磁性納米顆粒混合均勻，引發S1-ATRP反應，在磁性顆粒表面原位生成大量毛發狀聚甲基丙烯酰胺葡糖糖聚合物鏈，之后將聚合物側鏈葡萄糖上的鄰二羥基基團通過高碘酸鈉氧化反應，轉化為醛基，并利用兩弗堿反應將所引入的醛基與蛋白酶的N-端或側鏈氨基反應，將其固定于親水聚合物側鏈上。
[0027]使用時，直接將蛋白質與親水聚合物雜化磁性顆粒固定酶混合均勻，在37°C水浴中孵育1-2分鐘，即可完成酶解。之后取出管中的酶解產物點于基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀靶上，進行質譜分析。也可使用色譜自動進樣系統，進行液相色譜-電噴霧質譜聯用分析。
[0028]本發明提供的技術方案具有以下優點:
[0029]1、二氧化硅包裹的磁性納米顆粒表面由S1-ATRP法制備的毛發狀親水聚合物鏈所修飾，聚合物側鏈帶有大量醛基官能團，而且非交聯的毛發狀親水聚合物鏈還可支持三維立體化、多層蛋白酶固定。因此，與采用傳統單層覆蓋模式制備的固定化酶相比，該毛發狀親水聚合物雜化磁性顆粒固定化酶可明顯提高的蛋白酶的固載量。
[0030]2、與傳統固定化酶將蛋白酶固定于堅硬基體材料表面相比，此親水聚合物雜化磁性顆粒固定化酶中的蛋白酶固定于柔軟的聚合物鏈上，具有更大的自由度，有利于酶與蛋白質底物的充分接觸，從而促進酶解的進行。
[0031]3、與傳統溶液酶解需要12-20小時才能完成相比，該親水聚合物雜化磁性顆粒固定化酶完成蛋白質酶解所需時間極短(1-2分鐘)，大大加快了樣品處理速度。
[0032]4、與使用常規疏水基體材料制備的固定化酶相比，該親水聚合物基體材料顯著降低了對蛋白質及其酶解產物的非特異性吸附，從而提高了樣品回收率和蛋白質定量的準確度。
[0033]5、該固定化酶使用簡單方便。酶解完成后，通過一步磁性分離即可將酶解產物與磁性顆粒固定化酶分離。
[0034]6、該固定化酶 具有很高的酶解效率、完全性和樣品回收率，有助于提高復雜蛋白質組樣本以“鳥槍法”鑒定策略進行定性和定量分析時結果的可靠性、準確性和靈敏度，因此特別適用于復雜蛋白質組樣品的處理分析。
[0035]7、酶可多次重復使用。每次使用后,可通過磁性分離予以回收。經50次重復使用，酶解效率未見下降。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為本發明制備毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒固定化蛋白酶的工藝流程圖。
[0037]圖2為熒光蛋白BSA-FITC與未經親水聚合物修飾的二氧化硅包裹磁性顆粒混合后的熒光顯微鏡照片(a);用200μυΒ3(ΡΗ = 7.4)清洗5次后的熒光顯微鏡照片(b)；BSA-FITC與親水聚合物雜化磁性顆粒混合后的熒光顯微鏡照片(c);用200 μ LPBS (PH =
7.4)清洗I次的熒光顯微鏡照片(d)。
[0038]圖3為未經親水聚合物修飾的磁性納米顆粒的熱重分析曲線(a);親水聚合物雜化磁性顆粒的熱重分析曲線(b)。
[0039]圖4 =BSA標準蛋白質經溶液胰蛋白酶酶解12小時后鑒定到的肽段(允許I個漏切位點)對BSA的氨基酸序列覆蓋率。斜體字部分為鑒定到的氨基酸序列。
[0040]圖5:BSA標準蛋白質經親水聚合物雜化磁性顆粒固定化胰蛋白酶酶解I分鐘后鑒定到的肽段(允許I個漏切位點)對BSA的氨基酸序列覆蓋率。粗體字部分為鑒定到的氨基酸序列。
[0041]圖6 =BSA標準蛋白質經親水聚合物雜化磁性顆粒固定化蛋白內切酶Glu-C酶解I分鐘后鑒定到的肽段(允許I個漏切位點)對BSA的氨基酸序列覆蓋率。粗體字部分為鑒定到的氨基酸序列。
[0042]圖7為騰沖嗜熱菌全蛋白提取物分別經溶液酶解和親水聚合物雜化磁性顆粒固定化酶酶解后，使用10% SDS-PAGE(銀染)考察酶解完全性。泳道I為蛋白質分子量標準(Protein marker)，泳道2為未經酶解的騰沖嗜熱菌全蛋白提取物，泳道3為溶液酶解產物，泳道4為固定化酶解產物。泳道2-4中，每條泳道上樣量為2 μ g。
【具體實施方式】
[0043]下面通過具體實施例對本發明的方法進行說明，但本發明并不局限于此。下述實施例中所述實 驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0044]下述實施例中所用的二氧化硅包裹的四氧化三鐵磁性納米顆粒是按照下述方法制備得到的:將2.31g四氧化三鐵磁性納米顆粒(購自北京德科島金科技有限公司，粒徑為20nm)加入40ml乙醇中超聲60min后，向該懸浮液中加入1.5ml 25% (v/v)氨水、6ml水、
1.5ml正硅酸乙酯，在40°C水浴中劇烈攪拌2h后，超聲60min之后，用40ml乙醇漂洗3次，重新懸浮于40mL乙醇中，60°C回流加熱12h。最后將所得二氧化硅包裹磁性納米顆粒重新懸于60mL乙醇中室溫保存備用。經二氧化硅包裹后的顆粒粒徑為57.4nm, 二氧化硅厚度為18.7nm。
[0045]實施例1、制備毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒固定化蛋白酶
[0046]按照圖1所示的工藝流程進行制備。
[0047]1.1S1-ATRP引發劑的合成。使用3_氨基丙基三乙氧基硅烷與2_溴異丁酰溴反應合成一端為能與二氧化硅包裹磁性納米顆粒表面結合的硅烷偶聯劑，另一端為ATRP引發劑的S1-ATRP引發劑。具體如下:將8mmol 3-氨丙基三乙氧基硅烷與IOmmol三乙胺加入到12.5ml四氫呋喃中，混合后通入氮氣除氧同時冰浴30min,之后將IOmmol 2-溴異丁酰溴緩慢滴加到混合液中并且劇烈攪拌4h (持續通氮氣)，最后將溶液過濾后真空干燥至原始體積的1/3以去除四氫呋喃與三乙胺，離心后去除沉淀，氮氣吹干后可得到黃色粘稠狀S1-ATRP引發劑，充氮氣后密閉4°C保存。
[0048]1.2S1-ATRP引發劑的固定。利用S1-ATRP引發劑上的硅烷偶聯劑與包裹二氧化硅的磁性納米顆粒表面的硅羥基發生脫水反應生成硅氧鍵共價連接，從而將S1-ATRP引發劑固定在磁性顆粒表面上。首先通過酸堿處理暴露二氧化硅包裹磁性顆粒表面的硅羥基，即:使用0.1M HCl溶液浸泡磁性顆粒，30分鐘后將HCl溶液去除，用水清洗磁性顆粒至溶液pH為7左右，再使用0.1M NaOH溶液浸泡磁性顆粒，30分鐘后將NaOH溶液去除，用水清洗磁性顆粒至溶液pH為7左右。之后將含有500 μ M S1-ATRP引發劑的乙醇溶液與處理后的磁性顆粒混合，室溫下反應10小時后去除剩余引發劑，并用甲醇溶液清洗磁性顆粒，氮氣吹干。
[0049]1.3甲基丙烯酰胺葡萄糖單體的合成。向674.53 μ I甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)中加入0.2Μ硫酸，放置于50°C水浴中加熱4小時。再加入1.09g高碘酸鈉混合，室溫避光放置超過2小時。稱取0.4克氫氧化鈉溶解于20毫升甲醇中，加入1.1克氨基葡萄糖，攪拌至溶解。將氧化的GMA逐滴加入持續攪拌的氨基葡萄糖溶液中，攪拌直至呈黃色透明溶液，并將制備好的溶液氮氣揮發掉多余甲醇至產物呈膏狀，密閉充氮氣后放置4°C保存。
[0050]1.4引發S1-ATRP反應，在包裹二氧化硅的磁性納米顆粒表面原位生成聚甲基丙烯酰胺葡萄糖聚合物鏈。所用單體為1.3中合成的一端帶有雙鍵另一端帶有葡萄糖的甲基丙烯酰胺葡萄糖。將單體、催化劑(氯化亞銅)、配體(1，1，4，7，7-五甲基二亞乙基三胺)按照摩爾比200: I: 1.5加入甲醇中并超聲處理使其溶解并混合均勻。將上述反應液與已固定了 S1-ATRP引發劑的磁性顆粒混合，采用冷凍-抽真空-解凍-沖氮氣的方法除去體系中的氧氣，如此循環3次，之后用封口膜封口，室溫反應24小時。反應完成后用PBS (pH= 8.0)清洗、去除剩余反應物，得到毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒。采用動態光散射儀對毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒進行表征，顆粒粒徑為84.4nm，毛發狀親水聚合物層厚度為13.5nm。
[0051]1.5包裹二氧化硅的磁性顆粒的表面親水聚合物側鏈葡萄糖的醛基功能化。具體方法如下:將IOmM高碘酸鈉與1.4制備的親水聚合物雜化磁性顆粒混合均勻，在室溫反應2小時。
[0052]1.6在磁性顆粒表面的親水聚合物側鏈上進行蛋白酶固定。具體方法如下，將2mg胰蛋白酶或蛋白內切酶Glu-C溶解于Iml 50mM碳酸氫銨溶液(pH = 8.0)，并加入
0.1ml50mg/ml氰基硼氫化鈉溶液,混合均勻后加入到0.2ml濃度為250mg/ml的醒基功能化的親水聚合物雜化磁性顆粒溶液中，40C反應12小時后使用磁鐵將親水聚合物雜化磁性顆粒吸附于管壁，除去上清液。通過對該上清液在280nm處的紫外吸收值計算上清液中殘留的酶量，從而得出胰蛋白酶或蛋白內切酶Glu-C在親水聚合物雜化磁性顆粒上的固載量分別為247 μ g/mg或213 μ g/mg。之后使用50mM碳酸氫銨溶液清洗,去除剩余反應物。
[0053]1.7親水聚合物側鏈剩余醛基的封閉。配置含10% (V/V)氨基乙醇的磷酸鹽緩沖液PBS (pH = 8.0)，將其與固定了蛋白酶的親水聚合物雜化磁性顆粒混合，4°C下反應4小時。之后用50mM碳酸氫銨溶液反復清洗，凍干后備用。即得到毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒固定化蛋白酶。
[0054]如圖2所示，圖2a為包裹二氧化硅的磁性顆粒與熒光蛋白BSA-FITC混合后的熒光顯微鏡照片，圖2b為PBS (PH = 7.4)溶液清洗該磁性顆粒5次后熒光顯微鏡照片；圖2c為親水聚合物雜化磁性顆粒與BSA-FIT`C混合后的熒光顯微鏡照片，圖2d為PBS (PH = 7.4)溶液清洗該磁性顆粒I次后的熒光顯微鏡照片。從圖中可看出，經親水聚合物修飾后，清洗過的顆粒上基本沒有熒光蛋白殘留，而包裹二氧化硅的磁性顆粒清洗后有大量熒光蛋白殘
&3甶O
[0055]毛發狀親水聚合物雜化磁性納米顆粒由可熱分解從而導致質量損失的聚合物層和不可熱分解的磁性顆粒核心兩部分組成。分別稱取500mg親水聚合物雜化磁性納米顆粒和未經修飾的磁性納米顆粒，進行熱重分析，結果見圖3。從圖3中可看出，未經聚合物修飾的磁性顆粒隨熱處理溫度的提高無明顯質量損失(曲線a)。而聚合物修飾的磁性顆粒，隨熱處理溫度的提高，表現出明顯的質量損失(約24.17% )，證明通過S1-ATRP法在磁性顆粒表面原位聚合生成甲基丙烯酰胺葡萄糖聚合物是高度有效的。
[0056]實施例2
[0057]稱取適量牛血清白蛋白(BSA)標準蛋白(其序列如序列I所不)，溶解于50mM碳酸氫銨溶液中(pH = 8.0)中，終濃度為2 μ g/μ I。加入IOmM巰基乙醇(DTT)，按IAA與DTT的終濃度摩爾比例為5: 1，加入IAA溶液，暗處放置I小時將蛋白質變性。取已變性的蛋白質溶液50μ I (濃度I)與IOmg親水聚合物雜化磁性顆粒固定化胰蛋白酶混合，置于37°C水浴中反應I分鐘后使用磁鐵將磁性顆粒固定化酶吸附于管壁，并將上清中的蛋白質酶解產物取出。取同樣量的已變性的蛋白質溶液，按照常規酶解條件，按質量比
1: 50 (胰蛋白酶:蛋白質底物)加入胰蛋白酶，置于37°C水浴中孵育12小時后加入質量濃度為0.1% TFA(三氟乙酸)將胰蛋白酶滅活。分別取固定化酶酶解和常規溶液酶解產物點于基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀靶上并自然風干，再點上CHCA基質(5mg/ml，溶解于50%乙腈，0.1% TFA中)，待結晶后進行質譜分析。所得數據文件分別提交給在線MASCOT搜庫軟件進行肽質量指紋圖譜分析。分析結果表明，在允許一個漏切位點的條件下，從溶液胰蛋白酶酶解產物中鑒定到的肽段僅覆蓋了 BSA氨基酸序列的66% (圖4)，而用固定化胰蛋白酶酶解所得BSA序列覆蓋率高達93% (見圖5)。采用實施例1制備的毛發狀親水聚合物雜化磁性顆粒固定化胰蛋白酶對BSA進行酶解，重復使用50次后，酶解效率仍達到90%以上。
[0058]實施例3 [0059]稱取適量牛血清白蛋白(BSA)標準蛋白，溶解于50mM磷酸鹽緩沖液(pH = 7.8)中，終濃度為2 μ g/μ I。加入IOmM巰基乙醇(DTT)，按IAA與DTT的終濃度摩爾比例為5: 1，加入IAA溶液，暗處放置I小時將蛋白質變性。取已變性的蛋白質溶液50μ I(濃度
2μ g/ μ I)與IOmg親水聚合物雜化磁性顆粒固定化蛋白內切酶Glu-C混合，置于37°C水浴中反應I分鐘后使用磁鐵將磁性顆粒固定化酶吸附于管壁，并將上清中的蛋白質酶解產物取出。取固定化酶酶解產物點于基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀靶上并自然風干，再點上CHCA基質(5mg/ml，溶解于50 %乙腈，0.1 % TFA中)，待結晶后進行質譜分析。所得數據文件分別提交給在線MASCOT搜庫軟件進行肽質量指紋圖譜分析。分析結果表明，在允許一個漏切位點的條件下，用固定化蛋白內切酶Glu-C酶解所得BSA序列覆蓋率高達92%(見圖6)。采用實施例1制備的毛發狀親水聚合物雜化磁性顆粒固定化蛋白內切酶Glu-C對BSA進行酶解，重復使用50次后，酶解效率仍達到90%以上。
[0060]實施例4
[0061]騰沖嗜熱菌全蛋白提取
[0062]配置全蛋白提取液:50mMTris-HCl (pH = 8.0)，8M 尿素，2mM EDTA。向 500 μ I 提取液加入10 μ I的“雞尾酒”式蛋白酶抑制劑(Roche德國)，混合均勻后加入到裝有騰沖嗜熱菌的試管中，超聲破碎細胞。之后在4°C下20000g離心20分鐘，去除未破碎細胞及碎片，溶液即為騰沖嗜熱菌全蛋白。之后在蛋白質溶液中加入4-5倍體積的冷丙酮溶液(_20°C預冷)，_20°C放置大于2小時后4°C 12000g離心10分鐘，仔細吸取上清，保留沉淀。將沉淀放置于通風櫥中，使剩余丙酮充分揮發。將丙酮沉淀得到的蛋白質重新溶解在8M尿素緩沖液中并采用Bradford法測定蛋白質濃度。
[0063]騰沖嗜熱菌全蛋白固定化酶酶切
[0064]配置2mg/ml騰沖嗜熱菌全蛋白溶液，加入DTT，37°C水浴中還原4小時，之后加入IAA于暗處放置I小時進行烷基化。向處理好的蛋白質溶液中加入50mM碳酸氫銨溶液，混合均勻后等分為兩份，一份加入實施例1制備的10 μ I親水聚合物雜化磁性顆粒固定化胰蛋白酶，37°C水浴中孵育2分鐘后，使用磁鐵將磁性顆粒固定化酶吸附于管壁，吸取上清中的酶解產物。另一份按照常規溶液酶解條件，加入(質量比為1: 50的胰蛋白酶:蛋白質底物)胰蛋白酶，置于37°C水浴中孵育16小時后加入0.1 % TFA將胰蛋白酶滅活。分別取固定化酶酶解和常規溶液酶解產物使用液相色譜-電噴霧質譜聯用進行鑒定，并將鑒定得到的數據使用MASCOT軟件進行搜庫。使用常規溶液酶解，單次液-質連用分析，從騰沖嗜熱菌全蛋白提取液中共鑒定到439個蛋白質；而使用固定化酶解，在同樣的鑒定條件下，共鑒定到468個蛋白質。固定化酶酶解在大幅縮短酶解所需時間的同時提高了蛋白質的鑒定數量。使用10%的SDS-PAGE對固定化酶解和溶液酶解產物中的未酶解的殘留蛋白質進行考察發現:溶液酶解產物中有多條殘留蛋白質對應的條帶出現(圖7，泳道3)，而固定化酶解的產物中基本看不到殘留蛋白質對應的條帶(圖7，泳道4)。以上結果說明親水聚合物雜化磁性顆粒 固定化酶可成功應用于復雜蛋白質組樣本的快速、高效酶解。
【權利要求】
1.一種制備聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶的方法，包括下述步驟: 1)合成一種一端為能與二氧化硅包裹磁性納米顆粒結合的硅烷偶聯劑、另一端為原子轉移自由基聚合引發劑的表面引發原子轉移自由基聚合引發劑，記為S1-ATRP引發劑； 2)使所述S1-ATRP引發劑中的硅烷偶聯劑與二氧化硅包裹的磁性納米顆粒表面的硅羥基反應，從而將S1-ATRP引發劑共價連接于所述二氧化硅包裹的磁性納米顆粒表面； 3)在單體和催化劑體系存在下，于步驟2)得到的二氧化硅包裹的磁性納米顆粒表面引發原子轉移自由基聚合反應，在其表面原位生成毛發狀聚合物鏈；其中，所述單體為能用于原子轉移自由基聚合的單體，且在所述單體中含有能與待固定化的酶反應的官能團或在所述單體中含有經化學修飾后能與待固定化的酶反應的官能團； 4)分為下述a)或b): a)步驟3)中所述單體中含有能與待固定化的酶反應的官能團，使步驟3)中所述聚合物鏈上的官能團與待固定化的酶反應，將酶連接到所述聚合物鏈上，再將所述聚合物鏈上未與酶反應的官能團封閉，得到所述聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶； b)步驟3)中所述單體中含有經化學修飾后能與待固定化的酶反應的官能團，將步驟3)中所述聚合物鏈上的官能團進行化學修飾，使其轉變為能與待固定化的酶反應的官能團，然后再與待固定化的酶反應，將酶連接到所述聚合物鏈上，再將所述聚合物鏈上未與酶反應的官能團封閉，得到所述聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)中所述S1-ATRP引發劑是由3-氨基丙基三乙氧基硅烷與2-溴異丁酰溴通過氨基與酰溴反應生成酰胺鍵得到的。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述單體為親水性單體，優選為甲基丙烯酰胺葡萄糖、丙烯酸類單體、丁烯酸類單體或戊烯酸類單體。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述步驟4)為:將步驟3)中所述聚合物鏈上的葡萄糖中的鄰二醇結構氧化生成醛基，然后與待固定化的酶反應，將酶連接到所述聚合物鏈上，再將所述聚合物鏈上剩余的醛基用氨基乙醇封閉。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述催化劑體系由催化劑和配體組成；所述催化劑選自下述任意一種金屬的鹵化物:Cu、Mo (IV)、Ru、Rh、Fe、Re、N1、Pd和pb,優選氯化亞銅； 所述配體選自下述任意一種:1，1，4，7，7-五甲基二亞乙基三胺、聯吡啶、四甲基乙二胺、1，1，4，7，10，10_六甲基三亞乙基四胺和三(N，N—二甲基氨基乙基)胺；所述單體、催化劑、配體的摩爾比為200: (0.5-5): (0.75-7.5)。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于:所述酶為蛋白酶或糖苷酶；所述蛋白酶具體為胰蛋白酶、蛋白內切酶或胞內蛋白酶；所述糖苷酶具體為肽N-糖苷酶F。
7.權利要求1-6中任一項所述方法制備得到的聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶。
8.權利要求7所述的聚合物雜化磁性納米顆粒固定化酶在蛋白質快速酶解中的應用。
9.一種快速酶解蛋白質的方法，包括下述步驟:將變性的蛋白質樣品與聚合物雜化磁性顆粒固定化酶溶解于pH = 8.0、25-100mM碳酸氫銨溶液中或pH = 7.8的磷酸鹽緩沖液并混合均勻，25-50°C水浴孵育1-2分鐘即完成酶解。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于:所述方法還包括酶解完成后，使用磁鐵將所述聚合物雜化磁性顆粒固定化酶吸附在管壁上，并吸取上層清液中的酶解產物。
【文檔編號】C12P21/06GK103667241SQ201210347692
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月18日 優先權日:2012年9月18日
【發明者】錢小紅, 秦偉捷, 蔡耘, 徐龍, 范超 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所