一種指甲隱球菌及其分離培養方法與應用的制作方法

            文檔序號:413399閱讀:837來源:國知局
            專利名稱:一種指甲隱球菌及其分離培養方法與應用的制作方法
            技術領域
            本發明涉及生物技術領域,具體涉及一種指甲隱球菌及其分離培養方法與應用。
            背景技術
            隨著實驗室診斷技術的不斷改進,對隱球菌的分類越來越系統化,一般分為新生隱球菌、淺白隱球菌、指甲隱球菌、羅倫氏隱球菌、黃色隱球菌等。指甲隱球菌是一種帶有莢膜的擔子菌酵母,既往認為該菌僅引起人類甲真菌病。[Manzano-Gayosso P,Hernandez-Hernandez Fj Mendez-Tovar LJj et al. Onychomycosis incidence in type 2diabetes mellitus patients. Mycopathologia. 2008 Jul;166 (I):41-5.]現有文獻也顯示指甲隱球菌也能引起腦膜炎或其他真菌感染(參見文獻張旭輝,指甲隱球菌腦膜炎I例,《川北醫學院學報》,1993年04期,81頁;鄺俊健等,對I例左·脛腓骨骨折術后指甲隱球菌感染患者的藥學監護,《中國藥物應用與監測》2011年第I期,32-34頁)。但這些研究并未對指甲隱球菌的鑒定方法和藥物敏感性進行描述。目前,尚無從腦膜炎患者肺部活檢組織和腦脊液中分離培養純化的指甲隱球菌。

            發明內容
            本發明的目的在于分離培養純化一株新的可致人類腦膜炎的指甲隱球菌(Cryptococcus uniguttulatum)菌株,并提供其分離培養純化方法,以及該菌株在篩選抗真菌藥物中的應用。上海長征醫院皮膚科在一名37歲男性腦膜炎患者肺部活檢組織和腦脊液中分離出一株隱球菌,經ITS測序和核糖體基因D1/D2區測序證實為指甲隱球菌。本發明提供了一株指甲隱球菌(Cryptococcus uniguttulatus),已于2012年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(061 0,地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號,中國科學院微生物研究所,保藏編號為CGMCC No. 6017。本發明分離純化的該株指甲隱球菌,屬擔子菌門(Basidiomycota),銀耳目(Tremellales),線黑粉菌屬(Filobasidiella)。本發明還提供了所述的指甲隱球菌的分離培養純化方法,該方法包括分離純化步驟,具體是將隱球菌腦膜炎患者肺部活檢組織或腦脊液在30°C條件下接種于沙氏瓊脂培養基平板和酵母浸出膏蛋白胨(YEPD)瓊脂培養基,第2天生長,得到指甲隱球菌菌落。進一步地,該方法包括指甲隱球菌菌種在30°C條件下于沙氏液體培養基和酵母浸出膏蛋白胨(YEPD )液體培養基進行振蕩培養用于增菌。所述的指甲隱球菌的分離培養純化方法,該方法還包括培養和保存步驟,具體是從-70 V冰箱中取出凍存管,立即放置于37°C水浴中并適當搖動30s,打開凍存管,取50 μ I菌液接入沙氏斜面培養基上;保存時將菌液涂布平板,48小時后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEH)液體培養基中_70°C凍存;所述的沙氏斜面固體培養基的組分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、瓊脂I. 5%,每1000ml,加200mg氯霉素,121。。10分鐘滅菌后備用;所述的YEro液體培養基的組分和重量百分比如下1%酵母浸出膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖。本發明對該菌株的形態特征、培養特征、碳源利用作了進一步研究。本發明對該菌株進行鑒定采用指甲隱球菌ITS1、5. 8S rDNA和ITS2區擴增測序方法,具體為合成以下真菌通用引物上游引物ITS5 :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);和下游引物ITS4 :5,-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID N0:2 所示);以基因組擴增,PCR反應體系 50 μ L 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mmol/LdNTP 混合 物 8 μ L,IOumoI/L 弓丨物各 Iul,模板 2ul,Taq 酶 O. 5ul,無菌水 32. 5 μ L ;PCR擴增條件94°C預變性5分鐘,94°C變性30秒,55°C退火30秒,70°C延伸2分鐘,30個循環;72°C保存10分鐘。所得擴增產物由ABI 3730DNA自動測序儀雙向測序兩次。序列如SEQ ID NO: I所
            /Jn ο將測序結果于NCBI網站進行序列比對(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast, cgi),比對結果與指甲隱球菌菌株(ATCC 66033)同源性100%。合成Dl/D2引物上游引物5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’ (如 SEQ ID NO:4 所示);下游引物5’-GGTCCGTCTTTCAAGACGG-3’ (如 SEQ ID NO:5 所示);以基因組擴增,PCR反應體系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L,2. 5mmol/LdNTP 混合物 8 μ L,IOumoI/L 弓丨物各 Iul,模板 2ul,Taq 酶 O. 5ul,無菌水 32. 5 μ L ;PCR擴增條件94°C預變性5分鐘,94°C變性I分鐘,55°C退火30秒,70°C延伸2分鐘,30個循環;72°C保存10分鐘。所得擴增產物由ABI 3730DNA自動測序儀雙向測序兩次,序列如SEQID N0:6所
            /Jn ο將測序結果于NCBI網站進行序列比對(http: //blast, ncbi. nlm. nih. rov/Blast, cgi)比對結果與指甲隱球菌(TJYlla)同源性99%。本發明還提供了該菌株在篩選抗真菌藥物中的應用。所述的抗真菌藥物具體為抗人類腦膜炎藥物。參照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing ofYeasts.Approved standard M27-A3. Wayne, PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.),對該指甲隱球菌對兩性霉素b、氟胞B密唳、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和isavuconazole的藥物敏感性進行測定。其MIC值分別為O. 125、>64、64、1、0. 5,0. 5和0. 5mg/L。藥敏結果顯示該菌對氟胞嘧啶和氟康唑耐藥。抗該菌株的藥物具體為兩性霉素b、伏立康唑(voriconazole)、泊沙康唑(posaconazole)和isavuconazole。該菌株將進一步用于篩選新的抗真菌藥物。


            圖I是腦脊液墨汁染色普通顯微鏡圖。微生物保藏信息指甲隱球菌(PWH2010,),分類命名指甲隱球酵母Cryptococcus uniguttulatus,已于2012年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(061 0,地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號,中國科學院微生物研究所,保藏編號為CGMCC No. 6017。
            具體實施例方式現結合實施例和附圖,對本發明作進一步描述,但本發明的實施并不僅限于此。實施例I :本發明分離得到一株指甲隱球菌(Cryptococcus uniguttulatus)菌株CGMCCNo. 6017。 一、指甲隱球菌(Cryptococcus uniguttulatus)菌株 CGMCC No. 6017本發明的菌株(PWH2011)由上海長征醫院皮膚科于隱球菌腦膜炎患者肺組織和腦脊液中分離和檢測鑒定。于2012年4月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏登記號為CGMCCN0. 6017。屬擔子菌門(Basidiomycota),銀耳目(Tremellales),線黑粉菌屬(Filobasidiella)。I.形態特征腦脊液墨汁染色可見圓形酵母樣細胞,外有厚壁莢膜包繞,如圖I所示。2.培養特征該菌可在麥芽浸出培養基(MEA ;0xoid, Basingstoke, UK)、刀豆氨酸甘氨酸溴磨香草酚藍瓊脂培養基(CGB)培養基和L-多巴培養基上生長。該菌可在20°C、25°C和30°C下生長,但是在37°C和40°C未觀察到生長。在L-多巴培養基上培養2周菌落不變黑且無法使CGB培養基變色。CGB培養基制備甲液(甘氨酸10g,KH2PO4Ig, MgSO4Ig, thiamine HCllmg, L-canavanin sulphate 30mg, H2O 100ml,溶解各成分,pH 5. 6,0. 22 μ m 濾膜除菌)和乙液(溴百里酚藍 0. 4g,0. Olmol/LNaOH 64ml, H2O 36ml)。H2O 880ml,乙液 20ml,瓊脂 20g,121°C高壓滅菌15min,冷卻到48°C后加甲液100ml,充分混合,制成平板或斜面。3.碳源利用試驗方法參見工具書廖萬清等主編《真菌病學》,人民衛生出版社,1989年。試驗結果是可同化葡萄糖、蔗糖、D-葡萄糖醛酸酯。尿素試驗陽性。無法同化乳糖、蜜二糖、乙胺。二、菌株的分離培養及保存技術本發明設計的格特隱球菌的菌種分離純化技術包括隱球菌腦膜炎患者腦脊液接種于沙氏瓊脂培養基平板(30°C)和YEH)瓊脂培養基,第2天生長,得到指甲隱球菌菌落。菌種在30°C條件下于沙氏液體培養基和YEH)液體培養基30°C條件下進行振蕩培養用于增菌。所述指甲隱球菌的斜面培養和保存技術包括從-70°C冰箱中取出保存管,立即放置于37°C水浴中并適當搖動30s,打開凍存管,取I接種環菌液接入新鮮沙氏斜面培養基上。沙氏培養基配方葡萄糖4%、蛋白胨1%、瓊脂I. 5%,每1000ml加200mg氯霉素,121°C 10分鐘滅菌后備用。保存時將菌液涂布平板,48小時后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEro液體培養基中-70°c凍存。YEro液體培養基配方ι%酵母浸出膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖。三、真菌鑒定技術采用指甲隱球菌ITS1、5.8S rDNA和ITS2區擴增測序方法,具體為合成以下真菌通用引物上游引物ITS5 :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);和下游引物ITS4 :5,-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID NO:2 所示);以基因組擴增,PCR反應體系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L,2. 5mmol/LdNTP 混合物 8 μ L,IOumoI/L 弓丨物各 Iul,模板 2ul,Taq 酶 O. 5ul,無菌水 32. 5 μ L ;
            PCR擴增條件94°C預變性5分鐘,94°C變性30秒,55°C退火30秒,70°C延伸2分鐘,30個循環;72°C保存10分鐘。所得擴增產物由ABI 3730DNA自動測序儀雙向測序兩次,序列為tccgtaggtgaacctgcgga aggatcatta ttgaatttag ttgtctggct ttcgccgacgacgatatcattatccataacacctgtgcac tgttggatgt ttaatacatc cgttttacactaaacaatat tgttacaaatgtagtcttattataacataa taaaactttc aacaacggatctcttggctc tcgcatcgatgaagaacgcagc (如SEQ ID N0:3所示) 將測序結果于NCBI網站進行序列比對(http://blast, ncbi. nl m. nih. gov/Blast. cgi),比對結果與指甲隱球菌菌株(ATCC66033)同源性
            100%o合成Dl/D2引物上游引物5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’ (如 SEQ ID NO:4 所示);下游引物5’-GGTCCGTCTTTCAAGACGG-3’ (如 SEQ ID NO:5 所示);以基因組擴增,PCR反應體系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L,2. 5mmol/LdNTP 混合物 8 μ L,IOumoI/L 弓丨物各 Iul,模板 2ul,Taq 酶 O. 5ul,無菌水 32. 5 μ L ;PCR擴增條件94°C預變性5分鐘,94°C變性I分鐘,55°C退火30秒,70°C延伸2分鐘,30個循環;72°C保存10分鐘。所得擴增產物由ABI 3730DNA自動測序儀雙向測序兩次,序列為 taagcggagg aaaagaaact aacaaggatt cccctagtaa cggcgagcgaagcgggaagagctcaaatttgaaatctggt ggcctcaggt catccgagtt gtaatctata gaagtgttttccgtgctggc ccatgtacaagtcccttgga acagggcgtc atagagggtg agaatcccgtccttgacatggactaccagt gctctgtgatacactttcaa cgagtcgagt tgtttgggaatgcagctcaa aatgggtggtaaattccatc taaagctaaatattggcgag agaccgatagcgaacaagta ccgtgaggga aagatgaaaagcactttgga aagagagttaaacagtatgtgaaattgttg aaagggaaac gattgaagtc agtcgtgctcaatggactcagccgttctgcggtgtatttc cattgggtgg ggtcaacatc agttttgatcgctggataaaggcaggaggaatgtagcacc cccgggtgaa cttatagcct cttgtcacatacagtggttgggactgaggaacgcagcatg cctttatggc cgggattcgt ccacgtacatgcttaggatgttgacataatggctttaaac gacccgtctt gaaacacg(如 SEQ ID NO:6 所不)。將測
            NCBI 網立占進對亍序列比對(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cri) t匕又寸@果與指甲隱球菌(TJYlla)同源性100%。實施例2 :真菌藥敏實驗
            參照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.Approved standard M27-A3. Wayne, PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.),對該指甲隱球菌對兩性霉素b、氟胞B密唳、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和isavuconazole的藥物敏感性進行測定。其MIC值分別為O. 125、>64、64、1、
            O.5,0. 5和0. 5mg/L。藥敏結果顯示該菌對氟胞嘧啶和氟康唑耐藥。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解,本發明不受上述實施例的限制,上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理,在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進,這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。·
            權利要求
            1.一株指甲隱球菌(Cryptococcus uniguttulatus),保藏編號為 CGMCC No. 6017。
            2.根據權利要求I所述的指甲隱球菌的分離培養純化方法,其特征在于,該方法包括分離純化步驟如下將隱球菌腦膜炎患者肺部活檢組織或腦脊液在30°C條件下接種于沙氏瓊脂培養基平板和酵母浸出膏蛋白胨瓊脂培養基,第2天生長,得到指甲隱球菌菌落。
            3.根據權利要求I所述的指甲隱球菌的分離培養純化方法,其特征在于,該方法包括如下步驟指甲隱球菌菌種在30°C條件下于沙氏液體培養基和酵母浸出膏蛋白胨液體培養基進行振蕩培養用于增菌。
            4.根據權利要求I所述的指甲隱球菌的分離培養純化方法,其特征在于,該方法包括培養和保存步驟如下從-70°C冰箱中取出凍存管,立即放置于37°C水浴中并適當搖動30s,打開凍存管,取50 μ I菌液接入沙氏斜面培養基上;保存時將菌液涂布平板,48小時后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的酵母浸出膏蛋白胨液體培養基中-70°C凍存; 所述的沙氏斜面培養基的組分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、瓊脂I. 5%,每1000ml,加200mg氯霉素,121 °C 10分鐘滅菌后備用; 所述的酵母浸出膏蛋白胨液體培養基的組分和重量百分比如下1%酵母浸出膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖。
            5.根據權利要求I所述的指甲隱球菌在篩選抗真菌藥物中的應用。
            6.根據權利要求5所述的指甲隱球菌在篩選抗真菌藥物中的應用,該抗真菌藥物具體為抗人類腦膜炎藥物。
            全文摘要
            本發明涉及生物技術領域,具體涉及一種指甲隱球菌及其分離培養方法與應用。本發明提供了一株指甲隱球菌(Cryptococcus uniguttulatus),已于2012年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏編號為CGMCC No.6017。本發明對該菌株的形態特征、培養特征、碳源利用作了進一步研究。本發明還提供了該菌株的分離培養純化方法,以及在篩選抗真菌藥物中的應用。
            文檔編號C12N1/16GK102864084SQ20121034494
            公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
            發明者廖萬清, 潘煒華 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學
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