專利名稱：人體外周血誘導免疫抑制性b淋巴細胞的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及一種人抑制性B淋巴細胞的誘導培養、 純化以及潛在的細胞療法在自身免疫性疾病中的應用。
背景技術：
近年來，某些小鼠的B細胞亞群能分泌調節性的細胞因子以及具有免疫抑制效應的細胞稱為調節性B細胞。在小鼠的各種疾病模型中，尤其是自身免疫性疾病的小鼠模型中，研究者已經發現調節性B細胞的存在及其和疾病的發生、發展有一定的關聯。到目前為止，已經發現具有調節功能的B細胞包括Bla，T2-MZ前體細胞，BlO細胞(CD19hiCDldhiCD5+) 等。雖然它們的表型不同，但是這些B細胞都能分泌IL-10和/或TGF-β。我們最近的研究發現BAFF能夠體外誘導調節性BlO細胞的產生，而且將調節性BlO細胞輸入到自身免疫性關節炎以及I型糖尿病的小鼠模型中，能夠有效地抑制疾病的發生和發展。基于這些臨床前試驗的結果，我們提出是不是在人體也存在調節性B細胞的可能。事實上，人調節性B 細胞的存在已經被證實，據報道雖然人調節性B細胞在自身免疫性關節炎病人的外周血中的比例較正常人沒有很大改變，但是它們的抑制功能卻明顯降低。已經報道的人調節性B 細胞的亞群包括過度性B細胞(CD19hiCD24hiCD38hi)和記憶性B細胞(CD19hiCD24hiCD27+)。 但大量獲得具有免疫抑制功能的B細胞的方法還存在困難。基于報道和實驗基礎，我們提出BAFF可以誘導人抑制性B細胞的產生，并對這種抑制性B淋巴細胞的表型和功能特征進行鑒定。發明內容
本發明的目的是提供一種高效誘導及純化抑制性B淋巴細胞的方法，為臨床細胞療法在自身免疫性疾病的應用提供平臺。
本發明所述的人重組BAFF細胞因子誘導抑制性B淋巴細胞產生的方法，其步驟為
(I)從新鮮的人外周血中分離人外周血單個核細胞，然后置于含10%FBS的 RPMI1640培養液培養；
(2)在第1，3，5天，加入50ng/ml人重組BAFF細胞因子誘導抑制性B淋巴細胞的產生。
上述方法中，步驟(I)中將人外周血單個核細胞濃度調整為5 XlOfVml,培養體系 Iml0
本發明方法中，人外周血淋巴細胞在重組蛋白BAFF的誘導下產生抑制性B淋巴細胞；產生的抑制性B淋巴細胞經功能鑒定，表明BAFF誘導的B淋巴細胞對T淋巴細胞體外增殖具有抑制效果。
圖I :抑制性B淋巴細胞的表型鑒定
A，人外周血單個核細胞在BAFF的刺激下在體外誘導培養7天，用流式細胞技術檢測BAFF誘導的B淋巴細胞分泌IL-10的能力。如圖所示，百分比代表IL-10+B細胞占所有 B細胞的比例；
B，所表達的GITR和CD5以及IL-10B細胞所表達的GITR和CD5，百分比代表82% 的IL-IO+B細胞是GITR和CD5雙陽性。
圖2 :抑制性B淋巴細胞的功能鑒定
A，磁珠純化分選的⑶4+T細胞，用CFSE標記，然后用抗⑶3和抗⑶28誘導增殖，在培養體系中加入新鮮分離的B細胞，BAFF誘導的B細胞以及BAFF誘導并且分選純化的GITR+CD5+的雙陽性B細胞共同培養3天。百分比代表T細胞的增殖情況 (*，ρ〈0· 05;#, ρ<0. 01)。
具體實施方式
I.人外周血單個核細胞的純化新鮮的人外周血由健康志愿者提供。人外周血單個核細胞用Lymphoprep (Axis-Shield)分離。新鮮的人外周血標本用生理鹽水按I: I稀釋,取3ml稀釋的標本緩緩加入預先加入5ml Lymphoprep 的15ml離心管(BD)。離心管配平后，放入離心機(Beckman Coulter),室溫,離心力為600g,離心20min。小心取出離心管，用無菌吸管取出位于密度I. 077g/ml的細胞層，即為單個核細胞層。細胞用生理鹽水洗 2-3次，用細胞計數板計數。新鮮準備的外周血單個核細胞可以直接用于誘導抑制性B淋巴細胞，也可以凍存在液氮中。凍存液的配方如下RPMI1640的細胞培養液中加入15%DMS0 和30%FBS。凍存細胞的濃度為15-20XlO6Ail凍存液。用臺盼藍染色鑒定凍存復蘇后細胞的存活率一般大于95%。
2.抑制性B淋巴細胞的誘導培養5X106純化的單個核細胞加入24孔板中培養7 天，培養液為RPMI1640含10%FBS。在第1，3，5天，加入50ng/ml人重組BAFF細胞因子(購于P印rotech，編號310-13)誘導抑制性B淋巴細胞的產生。
3.抑制性B淋巴細胞的純化B淋巴細胞是用人CD19磁珠分選試劑盒分選純化的。每IO7細胞重懸在80 μ I緩沖液中，加入20 μ I⑶19磁珠混勻并在4-8° C孵育15min。 緩沖液的配方為PBS+0. 5%BSA+2mM EDTA。細胞用緩沖液洗2次，然后重懸在500 μ I緩沖液中。細胞用MACS柱子純化，收集結合在柱子上的細胞即為B淋巴細胞。
4.抑制性B淋巴細胞的表型鑒定為了檢測BAFF誘導的B淋巴細胞分泌IL-10的能力，細胞在培養 7 天后,加入 PMA(50pg/ml), ionomycin (500ng/ml)以及 Monensin (2 μ Μ) 再培養5h。取1-5 X IO6細胞用于鑒定細胞表面標記如⑶38，⑶24，GITR以及⑶5的表達； 同時細胞經破膜，固定后檢測細胞內IL-10的表達情況(結果如圖I)。
5.抑制性B淋巴細胞的功能鑒定為了鑒定BAFF誘導的B淋巴細胞的功能，同種T 淋巴細胞(⑶4+CD25_)用人⑶4磁珠分選試劑盒分選純化。純化的T淋巴細胞用CFSE標記， 然后和未誘導的純化的B細胞，BAFF誘導的B細胞以及BAFF誘導并分選純化的GITR陽性的B淋巴細胞按1:1的比例共同培養3天。T淋巴細胞用培樣板結合的⑶3和⑶28(1 μ g/ ml)刺激。如圖2所示，BAFF誘導的B淋巴細胞明顯抑制T淋巴細胞的增殖，而且GITR陽性的B細胞抑制效果更加明顯。
權利要求
1.人重組BAFF細胞因子誘導抑制性B淋巴細胞產生的方法，其步驟為 (1)從新鮮的人外周血中分離人外周血單個核細胞，然后置于含10%FBS的RPMI1640培養液培養， (2)在第1，3，5天，加入50ng/ml人重組BAFF細胞因子誘導抑制性B淋巴細胞的產生。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中，將人外周血單個核細胞濃度調整為5,106/ml,培養體系=ImL0
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及一種人抑制性B淋巴細胞的誘導培養、純化以及潛在的細胞療法在自身免疫性疾病中的應用。本發明無菌采集人外周血，采用LymphoprepTM(Axis-Shield)分離人單個核細胞，然后置于含10%FBS的RPMI1640培養液培養，同時在第1，3，5天，加入50ng/ml人重組BAFF細胞因子誘導抑制性B淋巴細胞的產生。本發明采用BAFF體外誘導人外周血B細胞分化為抑制性B淋巴細胞，該細胞表達IL-10，并且具有抑制T淋巴細胞增殖的能力。
文檔編號C12N5/0781GK102978158SQ20121034394
公開日2013年3月20日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者王勝軍, 芮棵, 楊敏, 呂力為 申請人:江蘇大學