專利名稱：一種以cd3+cd8+為主的活化淋巴細胞的擴增、凍存及復蘇方法
技術領域：
本發明涉及活化淋巴細胞的擴增、凍存以及復蘇方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
機體的免疫系統具有識別和殺傷腫瘤細胞的能力，已經獲得了大量研究數據的證實。近年來，腫瘤特異性細胞免疫治療在臨床實踐中顯示了非常令人興奮的療效。2002年，RosenbergSA等人在Science雜志報道了利用體外大量擴增的腫瘤特異性腫瘤浸潤淋巴細胞過繼回輸方法，他們在體外篩選出具有病人自身惡黑細胞特異性殺傷作用的腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)，大量擴增后回輸給自體病人。在這種方法中，經過體外IL-2和抗⑶3抗體 的聯合作用，數量高達1011的、腫瘤細胞高度特異的多種腫瘤抗原特異性識別的TILs被回輸至經清除淋巴細胞化療的病人體內，這些細胞以⑶3+⑶8+⑶56-的T細胞為主。在接受治療的13例病人中，6例病人完全緩解(CR，腫瘤完全消失)，4例病人部分緩解(PR，腫瘤消失50%以上,無新發腫瘤)。這10例病人均發生明顯的腫瘤縮小和/或消失。在Dr. Rosenberg的長期臨床實踐中，他們發現，利用來源于腫瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞進行晚期惡性黑色素瘤的治療，其有效率可達50%以上。Greenberg和Yee C的研究組在利用具有腫瘤特異性殺傷能力的CD8+T細胞克隆進行的治療中發現，多次使用這類細胞、聯合使用化療藥或不使用化療藥進行晚期惡性黑色素瘤病人的治療，可以使部分病人腫瘤長期穩定、明顯延長病人生存期。然而，在這些特異性細胞免疫治療過程中，存在著特異性細胞培養擴增的技術難題。首先，對于腫瘤浸潤淋巴細胞來說，(I)需要解決腫瘤組織體外原代培養的技術難題，以鑒定所獲得的腫瘤浸潤淋巴細胞對自體腫瘤有殺傷能力；(2)對于生命關鍵性器官所發生的腫瘤，需要鑒定特異性浸潤T淋巴細胞所識別是否為組織相關性抗原，以避免自身免疫病的發生。所謂組織相關性抗原，指的是在腫瘤中高表達，在正常對應的組織器官中低表達的腫瘤抗原。在免疫治療黑色素瘤時，可能會發生白癜風的副作用，而對如肝、腦等生命重要器官，由于這類抗原誘導的特異性殺傷細胞所可能產生的自身免疫病，使腫瘤浸潤淋巴細胞進行特異性免疫治療的應用受到限制。其次，對于使用抗原和樹突狀細胞(DC)進行體外腫瘤抗原特異性的淋巴細胞克隆來講，(I)需要通過Ieukophresis獲取大量的外周血單個核細胞以獲得DC和飼養細胞；(2)每一個目的抗原均須進行體外抗原刺激，以獲得腫瘤特異性T細胞克隆，技術復雜、耗時長、細胞用量大，限制了多種抗原特異性T細胞的獲得。另外，活化的淋巴細胞需多次輸注才能達到較好的治療效果，多數醫療單位利用血細胞分離機采集單個核細胞，而這種采集方法價格昂貴，多次采集給患者帶來心理及身體的痛苦。如果一次采集的單個核細胞可以凍存，當患者治療需要時，復蘇并誘導為活化的淋巴細胞，就為患者節約了費用，減輕了痛苦。傳統的體外擴增淋巴細胞的方法，是以CD3抗體作為淋巴細胞激活劑，并采用大劑量的IL-2，這樣雖然在短期內得到大量活化的T細胞，但很容易導致活化誘導的細胞死亡，最終難以獲得足夠數量的細胞毒性T淋巴細胞，并且含有大量的⑶4+⑶25+Treg細胞(見具體實施方式
14)。小劑量的抗⑶3單抗可以活化靜止的T細胞，誘導其產生殺傷腫瘤的作用，這種殺傷作用既包括對腫瘤細胞的直接殺傷，又包括分泌相關的細胞因子對腫瘤細胞產生間接殺傷，還可通過誘導腫瘤細胞發生凋亡對其產生作用。另一方面加入抗⑶3單抗后可以激活腫瘤細胞的凋亡途徑，導致凋亡細胞的數量增加，而這種凋亡作用主要通過Fas途徑產生。但大劑量加入CD3單抗進行培養時并未產生直線增加的殺傷和誘導作用，相反出現凋亡數量下降的現象，甚至出現對T細胞的抑制作用，壞死及凋亡細胞的數量均下降，這可能是因為T細胞受體(TCR)的數量有限，在過量的抗CD3單抗作用下，不但不能激活T細胞，反而會因受體表面被封閉而無法活化。
發明內容
為了解決了現有活化淋巴細胞制備(主要是指CIK細胞)純度低，增殖力低的缺 點。并解決病人因為多次使用細胞而需多次采血的問題。本發明聯和使用抗CD3單抗、抗CD28單抗、IL-2、IL-15等共同培養，另外通過免疫磁珠技術去除在培養過程中產生的CD4+CD25+Treg細胞，使得培養的細胞種類純度更高。本發明凍存以及復蘇的方法，可以解決患者為連續使用活化的⑶3+⑶8+為主的淋巴細胞而需多次采血的問題。我們在使用本發明所培養的活化的淋巴細胞治療的臨床觀察，在多名患者中，觀察到腫瘤的長期穩定、配合化療腫瘤的明顯縮小等現象。這種現象，與腫瘤特異性細胞免疫治療觀察到的效果類似。同時，活化的淋巴細胞群體中CD8+T淋巴細胞百分比越高，治療效果越好。因此，我們懷疑在這些“非特異性免疫細胞”中，可能存在腫瘤特異性CD8+殺傷性T淋巴細胞，發揮了其抗腫瘤效果。人體內T淋巴細胞包括許多針對不同抗原的特異性細胞，這些細胞經過培養后，理論上他們會針對不同的腫瘤抗原或病毒抗原具有廣泛的識別和殺傷效果。⑶28分子又稱TP44，是一種包括202個氨基酸的I型跨膜糖蛋白。可以提供T細胞活化所需的共刺激信號，促進T細胞活化增殖。利用CD28單抗作為CD28的配體，以CD3單抗激活TCR信號途徑，可有效地增強⑶3AK細胞的增殖活性，并延緩⑶3AK細胞的凋亡。⑶28共刺激使外周血淋巴細胞活化顯著促進細胞因子產生，⑶28單抗協同⑶3單抗可明顯提高外周血淋巴細胞上清中IFNy、IL-2、IL-4水平，并且CD28單抗能抑制IFNy、IL_2、腫瘤壞死因子(TNF)等的mRNA降解IL-2是主要由活化的T細胞分泌的重要的細胞生長因子。它最初是從絲裂原刺激的淋巴細胞的培養上清中純化出來的，是調節T淋巴細胞應答的一種重要的細胞因子。在抗原活化后，能促進T細胞的增值，但是在后期，隨著活化T細胞數量的增多和IL-2的濃度的逐漸升高，T細胞便很快地進入Fas/FasL介導的的活化誘導的細胞死亡(AICD)。，因此單純使用IL-2并不能是T細胞在體外較長時間的擴增IL-15也是一種重要的細胞生長因子，它主要由單核細胞和樹突狀細胞表達分泌，能夠促進NK細胞，T細胞和B細胞的增殖和分化。IL-15是由能夠刺激IL-2依賴的T細胞系的增殖，而且這種增殖效應不能被anti-IL-2抗體所阻斷。因此IL-15與IL-2具有相似的生物學效應，即兩者都能促進T細胞的分化增值，然而，與IL-2不同的是，IL-15受體結合后，能夠穩定rc鏈，且上調抗凋亡基因bcl-2，從而表現有抗AICD和延長細胞存活時間的作用。⑶4+⑶25+Treg細胞是自然產生并成熟于胸腺的獨特細胞群，占⑶4+T細胞5% —10%。它可通過細胞接觸依賴機制或抑制性細胞因子依賴機制主動抑制自身反應性T細胞的活化，維持自身免疫耐受，防止自身免疫病的發生。⑶4+⑶25+Treg細胞主要在機體免疫系統中發揮負向調節作用，既能抑制不恰當的免疫反應，又能限定免疫應答的范圍、程度及作用時間，對效應細胞的增殖、免疫活性的發揮起抑制作用。抑制性表現在Treg 細胞能夠抑制許多免疫細胞的活性、增殖及功能，如⑶4+Th細胞、⑶8+細胞毒性T細胞、⑶Id限制性NKT細胞、單核/巨噬細胞、初始/記憶B細胞和樹突狀細胞(DCs)等。經TcR介導的信號刺激可以是抗CD3單抗產生的多克隆的刺激，也可以是抗原特異性刺激，一旦被活化這種作用即為非抗原特異性，并且這種免疫抑制性不具有MHC限制性能夠抑制同種同型或同種異型T細胞的增殖。另外腫瘤患者免疫功能低下，外周血中總淋巴細胞降低，各淋巴細胞亞群比例紊舌L且血清中存在眾多免疫抑制因子，這些因素不利于外周血活化淋巴細胞的擴增，特別是在放療、化療之后，很難保證提供足夠數量的細胞。如果可以利用低溫凍存技術保存外周血單個核細胞，在需要時復蘇并誘導為有細胞毒活性的CIK細胞,這個問題就迎刃而解了。本發明的第一方面涉及一種以⑶3+⑶8+為主的活化淋巴細胞的擴增方法(a)將外周血血樣中分離出的單個核細胞在含有淋巴細胞激活劑和細胞因子IL-2的培養基中培養；所述淋巴細胞激活劑為抗CD3抗體和抗CD28抗體，抗CD3抗體的終濃度為O. l-100ng/ml ;抗CD28抗體的終濃度為O. l_50ng/ml ;所述IL-2終濃度為100U/ml至5000U/ml ；(b)將(a)步驟中培養得到的淋巴細胞用mini MACS磁珠分選去除CD4+CD25+Treg細胞；(C)將(b)步驟中培養得到的淋巴細胞在含有細胞因子IL-2和IL-15的培養基中培養；所述IL-2終濃度為50-500U/ml ; IL-15的終濃度為10_500ng/ml ；(d)收集(C)步驟中得到的淋巴細胞用于回輸或凍存。以下對本發明進行具體說明在本發明的方法中，其中所述步驟(a)抗⑶3抗體的終濃度優選為l_75ng/ml，抗CD28抗體的終濃度優選為2-30ng/ml。本發明的方法中，步驟(a)中使用的淋巴細胞激活劑還可以含有其他激活劑，例如PHA和/或IFN-r。優選的步驟(a)中的PHA的終濃度可以是例如l-100ng/ml，而IFN_r的終濃度可以是例如100-2000U/ml。本發明的方法中，為在短時間內獲得大量具有增殖能力的淋巴細胞，所以在培養基中加入高濃度的IL-2進行培養。步驟(a)中優選的IL-2的終濃度為2000_4000U/ml。本發明的方法中，為去除在培養過程中轉化增殖的CD4+CD25+Treg細胞使得培養的細胞CD8+T細胞純度更高，在步驟(b)中用mini MACS間接免疫磁珠正選去除CD4+CD25+Treg 細胞。本發明的方法中，步驟(C)中優選的IL-2的終濃度可以為例如200_500U/ml，優選的IL-15的終濃度可以為例如200-400ng/ml。
本發明的方法中，步驟(C)還可以含有其他類似功能細胞因子例如IL-7和/或IL-12和/或IL-21。優選的IL-7的終濃度為10_200ng/ml和/或IL-12的終濃度為5-100ng/ml和/或IL-21的終濃度為l_200ng/ml。更優選的IL-7的終濃度為50-1OOng/ml和/或IL-12的終濃度為20-50ng/ml和/或IL-21的終濃度為10-100ng/ml。在本發明的方法中，其中所述步驟(a)開始至步驟(b)結束所需時間為3-4天，步驟(C)中細胞培養如用于臨床回輸所需時間為6-8天，如用于細胞凍存所需時間為1-2天。本發明培養的細胞主要為⑶3+⑶8+T細胞，⑶3+⑶8+T細胞含量可大于90%。第二方面，本發明提供了一種活化的以⑶3+⑶8+為主的淋巴細胞的凍存方法(e)取生長在對數期的以⑶3+⑶8+為主的活化淋巴細胞進行收集，收集方法為以300-2000r/min的速度離心，10分鐘，得到沉淀細胞； (g)將在(e)步驟中得到的細胞加入凍存液使細胞濃度為O. 1-5XlOVml ;將細胞懸液轉入凍存管中；(h)將(g)中得到的細胞放于程序降溫盒中在零下20°C放置1-5小時，再轉于_80°C冰箱放置16-48小時，轉入液氮罐中長期凍存；在本發明的方法中，其中所述步驟(e)中所述對數期是指淋巴細胞總數為原始淋巴細胞總數的2-100倍時，優選的，是CD3+CD8+淋巴細胞總數為步驟(a)中原始分離得到的⑶3+⑶8+淋巴細胞的2-100倍，更優選的，是⑶3+⑶8+淋巴細胞總數為步驟(a)中原始分離得到的⑶3+⑶8+淋巴細胞的5-20倍；在本發明的方法中，其中所述步驟(e)中以⑶3+⑶8+為主的淋巴細胞的收集如下取細胞放于離心管中，以400-600r/min的離心速度離心10分鐘，除去上清液；在本發明的方法中，其中所述步驟(g)中所用凍存液為胎牛血清與DMSO按照9 1的體積比配制，也可為培養基與DMSO按照9:1的體積比配制，也可為胎牛血清和培養基的混合液體與DMSO按照9:1的體積比配制。在本發明的方法中，其中所述步驟(g)優選的為在零下20°C放置2-3小時，再轉于_80°C冰箱放置20-24小時。第三方面，本發明提供了一種以⑶3+⑶8+為主的凍存的自體活化淋巴細胞的復蘇以及復蘇后培養方法(i)取出(h)步驟中凍存的細胞，在37°C水浴鍋中速融；( j)將(i)中得到的細胞迅速轉入37°C預熱新鮮培養基中，然后轉入細胞培養板中培養；(k)吸取(j)中所培養細胞的培養基的上清，并重新加入含有細胞因子IL-2的新鮮培養基；所述IL-2的終濃度為1000-5000U/ml ；(I)待(k)中細胞長滿孔后，轉移至含有淋巴細胞激活劑的培養瓶中，并添加含有細胞因子IL-15的新鮮培養基；所述IL-15的終濃度200-500ng/ml ;所含淋巴細胞激活劑為抗⑶3抗體和抗⑶28抗體，抗⑶3抗體的終濃度為l-100ng/ml，抗⑶28抗體的終濃度為2-200ng/ml ；(m)待(I)中細胞數量擴增到2-10倍時，添加含有細胞因子IL_2以及IL-15的新鮮培養基進行擴大培養；所含細胞因子IL-2的終濃度為50-500U/ml，IL-15的終濃度為50_500ng/ml ；
(η)收集(m)中擴增活化的淋巴細胞。在本發明的方法中，其中所述步驟(k)中優選的IL-2的終濃度可以為例如1000-2000U/ml。在本發明的方法中，其中所述步驟(I)中優選的IL-15的終濃度可以為例如200-500ng/ml。在本發明的方法中，其中所述步驟(I)中優選的可以為抗CD3抗體的終濃度為50-100ng/ml，抗 CD28 抗體的濃度為 20_80ng/ml。在本發明的方法中，其中所述步驟(m)優選的細胞數量擴增的倍數是2-5倍。在本發明的方法中，其中所述步驟(m)中優選的IL-2的終濃度為50_200U/ml ，IL-15 的終濃度為 20-100ng/ml。在本發明的方法中，第一第二，第三方面中所述培養基為RPMI-1640培養基或其他效果類似的培養基，其中所述其他效果類似的培養基為DMEM培養基和/或AIM-V培養基。并且，第一，第二，第三方面的方法中，其中所述培養基可為同一種培養基，也可為RPMI-1640、DMEM、AM-V培養基中兩種或多種。此外，在淋巴細胞的培養過程中還可以向培養基中加入血清和血漿，血清或血漿的來源可以是自體的(來源和淋巴細胞相同)也可以是異體的(來源于淋巴細胞不同)但從安全角度考慮，優先的，選擇自體來源的血清或血漿，更優先的，選擇可不用添加血清或血漿的成品商業化無血清培養基例如AM-V。本發明的有益效果是現有活化淋巴細胞制備(主要是指CIK細胞)純度低，增殖力低，里面含有大量⑶4+⑶25+Treg細胞，⑶4+⑶25+Treg細胞會分泌大量免疫抑制因子，使得細胞回輸到體內后受到免疫抑制因子的影響后并不能發揮太大作用。并且因為大多數病人需要做化療，使得病人體內淋巴細胞活性降低，這就造成了現有活化淋巴細胞制備(主要是指CIK細胞)很難連續采血操作，影響了病人使用活化淋巴細胞的效果。本發明所培養的活化淋巴細胞成分清晰，⑶4+⑶25+Treg細胞含量極少，并含有大量的CD8+T淋巴細胞，我們在使用本發明所培養的活化的淋巴細胞治療的臨床觀察，活化的淋巴細胞群體中CD8+T淋巴細胞百分比越高，治療效果越好。本發明凍存以及復蘇的方法，可以解決患者為連續使用活化的⑶3+⑶8+為主的淋巴細胞而需多次采血的問題,從而可以根據病人其他治療如放療化療來調整活化淋巴細胞的回輸時間和次數，以更好的治療腫瘤，感染性疾病以及免疫缺陷癥等疾病。
圖I為未凍存的淋巴細胞形態；圖2為凍存后復蘇的細胞形態；圖3為未凍存淋巴細胞的細胞表型；圖4為凍存過后復蘇培養的淋巴細胞的細胞表型。
具體實施例方式I.淋巴細胞的活化取病人外周血50ml，分裝入離心管中，以1600r/min離心lOmin，去除上層血漿，力口Λ 30ml生理鹽水，混勻，將稀釋好的血細胞每30ml小心加入到15mlFicoll的上層中，然后離心2000r/min，20min。離心完畢后，取中間白細胞層，用生理鹽水反復洗滌3遍，加入37°C預熱的AIM-V培養基中，使細胞濃度為2 X 106/ml，加入抗⑶3抗體，抗⑶28抗體以及IL-2，使得抗CD3的濃度為60ng/ml，抗CD28抗體的濃度為15ng/ml，IL-2的濃度為4000U/ml ο然后將培養瓶放入二氧化碳培養箱，37°C，CO2濃度為5%。從培養的第二天開始，用顯微鏡進行觀察細胞生長狀況。2. CD4+CD25+Treg 細胞的去除細胞培養第三天左右，觀察細胞生長狀況，如果細胞生長良好，則進行此步操作。將細胞懸液調整到適宜的細胞濃度，加入PE-labeled antihuman⑶25，4°C孵育30min后取出，以MACS專用PBS離心洗滌3次，再加入Anti-PE磁珠，同樣置4°C孵育30min，過MACS柱，MACS柱內為陽性分選所得到的⑶4+⑶25+Treg細胞，洗脫下來的為去除Treg細胞所得 到的活化淋巴細胞。3.淋巴細胞的擴增將去除Treg細胞的淋巴細胞用AM-V培養基重懸，使得細胞濃度為2X106/ml，加入IL-2和IL-15使得IL-2的濃度為200U/ml，而IL-15的濃度為300ng/ml。連續用顯微鏡觀察細胞生長狀況，如果生長狀況良好，則加入根據細胞濃度加入相應的培養基和相應的細胞因子，使得細胞濃度維持在2X 106/ml，細胞因子濃度也維持在IL-2的濃度為200U/ml,而 IL-15 的濃度為 300ng/ml。4.細胞的收集如果細胞用于凍存，則在細胞培養第5天左右，⑶3+⑶8+淋巴細胞總數為原始分離得到的CD3+CD8+淋巴細胞的20倍時開始收集。如果用于回輸，則在細胞培養第10天左右進行收集。收集過程如下將細胞轉移到離心管中，1600r/min，離心10分鐘，細胞用生理鹽水洗滌兩次，如果凍存則加入相應凍存液；如果回輸，則重懸于5%的白蛋白生理鹽水中。5.細胞表型的檢測用含有1%人血清白蛋白的生理鹽水懸浮PBMC或活化淋巴細胞，冰浴10分鐘。用預冷的PBS洗滌細胞兩次(300g，4°C離心5min沉淀細胞團塊)。用預冷染色緩沖液重懸細胞至終細胞密度至2X107cells/ml。每管加入50 μ I細胞懸液。每管加入適量(各種抗體最適用量)抗體，包括FITC標記抗⑶3抗體,PE標記抗⑶25抗體，PE_Cy5標記抗⑶4抗體，APC標記抗⑶8抗體，PE標記抗⑶16抗體，APC標記抗⑶56抗體包括用于補償設置的單色管及加有各種同型對照的陰性管。冰浴避光孵育20min。每管加入Iml PBS，300g，4°C離心5分鐘。小心吸棄上清或傾去上清。重復洗滌過程一次。振蕩懸浮細胞沉淀。用O. 5毫升PBS重懸細胞。如細胞不能即時檢測，染色細胞必須用4%多聚甲醛4°C固定30分鐘，用染色緩沖液洗滌重懸細胞后4°C避光保存。上機檢測。檢測結果包括⑶4、⑶8比例及二者比值，⑶3+⑶4+⑶25+細胞亞群所占比例，CD3 + CD16 + CD56 +和 CD3-CD16 + CD56 +細胞亞群的檢測(見圖 3)。其中在剛開始分離的外周血單個核細胞中，T細胞約占40-70%，而經過本發明培養后，T細胞占細胞群的95%以上，其中⑶3+⑶8+T細胞的比例在90%以上。6.活化淋巴細胞的凍存
消化貼壁細胞或收集懸浮細胞，將細胞懸液收集至離心管中，IOOOrpm離心5 10分鐘，棄上清液，用一定量凍存液(凍存液為胎牛血清與DMSO按照9 :1的比例配制)將細胞重懸，計數，調整細胞密度至IO7個/ml左右，將細胞懸液分裝至2ml凍存管中，每管I I. 5ml，將凍存管口封，貼上標簽，做好記錄，按下列程序降溫20°C (I 2小時)一一 80°C(16 18小時或隔夜)一液氮(LN2)。7.活化淋巴細胞的復蘇從液氮罐中取出凍存管，立即放入37°C水浴內，輕晃凍存管使液體盡快融化，通常應在I分鐘內融化，用75%的酒精棉球擦拭凍存管及管蓋，將解凍的細胞懸液移至一定量的未加細胞因子的AIM-V培養基中，將細胞濃度稀釋到I. O X 106/ml，并轉入24孔培養板中培養，過夜。8.復蘇后細胞的繼續培養第二天，從每孔中取出一般上清液，并補充相應量的含有2000U/ml IL_2的新鮮培 養基，待細胞培養板的空內細胞長滿后，將細胞轉入培養瓶中培養，添加相應量的AIM-V培養基，并添加相應量的IL-15，以及抗⑶3單抗和抗⑶28單抗，使得IL-15的濃度為200ng/ml,抗0)3單抗的濃度為80ng/ml,抗0)28單抗的濃度為40ng/ml。待上述細胞擴增到其3倍時，加入新鮮的AIM-V培養基進行擴大培養，使細胞濃度在3X 106/ml，并添加相應細胞因子IL-2和IL-15，使IL-2的濃度在100U/ml, IL-15的濃度在 50ng/ml。9.復蘇后培養細胞的收獲細胞培養第11天左右進行活化淋巴細胞的收集。收集過程如下將細胞轉移到離心管中，1600r/min，離心10分鐘，細胞用生理鹽水洗滌兩次，重懸于5%的白蛋白生理鹽水中。10.復蘇后培養的淋巴細胞表型檢測用含有1%人血清白蛋白的生理鹽水懸浮活化淋巴細胞，冰浴10分鐘。用預冷的PBS洗滌細胞兩次(300g，4°C離心5min沉淀細胞團塊)。用預冷染色緩沖液重懸細胞至終細胞密度至2X107cells/ml。每管加入50 μ I細胞懸液。每管加入適量(各種抗體最適用量)抗體，包括FITC標記抗⑶3抗體，PE標記抗⑶25抗體，PE-Cy5標記抗⑶4抗體，APC標記抗⑶8抗體，PE標記抗⑶16抗體，APC標記抗⑶56抗體包括用于補償設置的單色管及加有各種同型對照的陰性管。冰浴避光孵育20min。每管加入Iml PBS，300g，4°C離心5分鐘。小心吸棄上清或傾去上清。重復洗滌過程一次。振蕩懸浮細胞沉淀。用O. 5毫升PBS重懸細胞。如細胞不能即時檢測，染色細胞必須用4%多聚甲醛4°C固定30分鐘，用染色緩沖液洗滌重懸細胞后4°C避光保存。上機檢測。檢測結果包括⑶4、⑶8比例及二者比值，⑶3+⑶4+⑶25+細胞亞群所占比例，CD3 + CD16 + CD56 +和 CD3-CD16 + CD56 +細胞亞群的檢測(見圖 4)。11.凍存復蘇后與未凍存活化淋巴細胞形態的比較倒置顯微鏡下觀察外周血單個核細胞呈懸浮生長，大小均勻，折光性一致，活化淋巴細胞經培養后部分細胞明顯增大，可見細胞集落，胞核密度加強，體積增大，胞膜光滑，未見突起。體積明顯大于普通淋巴細胞。新鮮與凍存后的單個核細胞誘導的活化淋巴細胞在形態上無明顯差別。
復蘇后的細胞呈異型性，細胞明顯增大，可見很多大小不一的細胞集落，胞核密度加強，體積增大細胞狀態良好(見圖1，圖2)12.凍存后復蘇與未凍存活化淋巴細胞的體外增殖情況及表型細胞培養過程中，每天取樣計數，結果顯示在初培養細胞數量為2. 5X107左右時未凍存細胞培養第10天和凍存后復蘇的細胞培養第11天左右時，細胞數量均可達到3X109左右，細胞表型中⑶3+⑶8+T細胞的比例均在90%以上，⑶4+⑶25+T細胞的比例均在5%以下13.凍存后復蘇與未凍存活化淋巴細胞體外殺傷活性的比較試劑①四甲基偶氮鹽(MTT, 10mg/ml);②酸化異丙醇含O. 04mol/L HCl的異丙醇；③96孔細胞培養板。腫瘤細胞系對數期生長的H印G2操作方法用含IL-2的10%FBS的RPMI-1640培養基調整凍存與未凍存活化淋巴細胞密度至I. 5 XlOVml ;取對數生長期細胞經不完全工作培養液洗滌，胎盼藍染色計數，以含10%FBS的RPMI-1640培養液調整細胞密度至2 X 106/ml備用。凍存與未凍存活化淋巴細胞與不同的靶細胞株按效靶為5:1，10 :1，20 :1的比例分別取100 μ I接種于96孔平底培養板內共同培養，每個試驗做三個復孔。設不同濃度效應細胞200 μ I/孔單獨培養測定效應細胞的吸光度。同時將靶細胞株用含10%FBS的RPMI-1640培養液調整至3X104 I X 105/ml，取100 μ I細胞懸液和100 μ I培養液接種于96孔培養板中，每個濃度接種3復孔，以測定不同濃度腫瘤細胞的吸光度；將上述接種好的細胞培養板置37°C，5%C02孵育20h ;于終止培養前，每孔加入MTT 10 μ 1，混勻后再培養4h ;吸棄上清液，每孔加入溶劑(酸化異丙醇)IOOy 1，稍振蕩待甲臜產物充分溶解；在酶標儀上，測定0D570-620nm ;細胞毒性百分率按下列公式計算
權利要求
1.ー種以⑶3+⑶8+為主的活化淋巴細胞的擴增方法，其特征是， Ca)將外周血血樣中分離出的單個核細胞在含有淋巴細胞激活劑和細胞因子IL-2的培養基中培養；所述淋巴細胞激活劑為抗CD3抗體和抗CD28抗體，抗CD3抗體的終濃度為O. l-100ng/ml ;抗CD28抗體的終濃度為O.ト50ng/ml ;所述IL-2終濃度為100U/ml至5000U/ml ； (b)將(a)步驟中培養得到的淋巴細胞用miniMACS磁珠分選去除CD4+CD25+Treg細胞； (c)將(b)步驟中培養得到的淋巴細胞在含有細胞因子IL-2和IL-15的培養基中培養；所述IL-2終濃度為50-500U/ml，IL-15的終濃度為10_500ng/ml ； (d)收集(c)步驟中得到的淋巴細胞用于回輸或凍存。
2.如權利要求I所述的擴增方法，其特征是，所述步驟(a)抗CD3抗體的終濃度為l-75ng/ml，抗 CD28 抗體的終濃度為 2_30ng/ml ;IL_2 的濃度為 2000_4000U/ml。
3.如權利要求I所述的培養方法，其特征是，步驟(c)中IL-2的終濃度為200-500U/ml，IL-15 的終濃度為 200-400ng/ml。
4.如權利要求I所述的擴增方法，其特征是，所述步驟(a)中使用的淋巴細胞激活劑還含有激活劑PHA和/或IFN-r ;所述PHA的終濃度為l-100ng/ml，而IFN_r的終濃度為100-2000U/ml。
5.如權利要求I所述的擴增方法，其特征是，所述步驟(c)還含有細胞因子IL-7、IL-12、IL-21中的ー種或幾種；所述IL-7的終濃度為10_200ng/ml，IL-12的終濃度為5-100ng/ml, IL-21 的終濃度為 l_200ng/ml。
6.如權利要求I所述的擴增方法，其特征是，所述培養基為RPMI-1640培養基、DMEM培養基或者AIM-V培養基。
7.權利要求1-6中任意一項所擴增的以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的凍存方法，其特征是， Ce)取權利要求1-6的生長在對數期的以⑶3+⑶8+為主的活化淋巴細胞進行收集，收集方法為以300-2000r/min的速度離心，得到沉淀細胞； (g)將在(e)步驟中得到的細胞加入凍存液使細胞濃度為O.lX 107-5X 107/ml ;將制備的細胞懸液轉入凍存管中； (h)將(g)步驟中得到的凍存管放于程序降溫盒中在零下20°C放置1-5小時，再轉于_80°C冰箱放置16-48小時，轉入液氮罐中長期凍存。
8.如權利要求7所述的凍存方法，其特征是，所述步驟(e)中對數期是指淋巴細胞總數為原始分離得到淋巴細胞總數的2-100倍；所述步驟(e)中以CD3+CD8+為主的淋巴細胞的收集為取細胞放于離心管中，以400-600r/min的離心速度離心10分鐘，除去上清液；所述步驟(g)中所用凍存液為胎牛血清與DMSO按照9 1的體積比配制，或者培養基與DMSO按照9:1的體積比配制，或者為胎牛血清和培養基的混合液體與DMSO按照9:1的體積比配制，所述培養基為RPMI-1640培養基、DMEM培養基或者AIM-V培養基；所述步驟(g)為在零下20°C放置2-3小時，再轉于_80°C冰箱放置20-24小時。
9.權利要求7或8凍存的以⑶3+⑶8+為主的活化淋巴細胞的復蘇方法，其特征是， (i)取出權利要求7或8的(h)步驟中凍存的細胞，在37°C水浴中速融；(j)將(i)中得到的細胞迅速轉入37°C預熱新鮮培養基中，然后轉入細胞培養板中培養; (k)吸取(j)中所培養細胞的培養基的上清，并重新加入含有細胞因子IL-2的新鮮培養基；所述IL-2的終濃度為1000-5000U/ml ； (I)待(k)中細胞長滿孔后，轉移至含有淋巴細胞激活劑的培養瓶中，并添加含有細胞因子IL-15的新鮮培養基；所述IL-15的終濃度200-500ng/ml ;所含淋巴細胞激活劑為抗⑶3抗體和抗⑶28抗體，抗⑶3抗體的終濃度為l-100ng/ml，抗⑶28抗體的終濃度為2-200ng/ml ； (m)待(I)中細胞數量擴增到2-10倍時，添加含有細胞因子IL-2以及IL-15的新鮮培養基進行擴大培養；所含細胞因子IL-2的終濃度為50-500U/ml，IL-15的終濃度為50_500ng/ml ； (η)收集(I)中擴增活化的淋巴細胞。
10.如權利要求9所述的復蘇方法，其特征是，所述步驟(k)中IL-2的終濃度為1000-2000U/ml ;所述步驟(I)中的IL-15的終濃度為200_500ng/ml，抗CD3抗體的終濃度為50-100ng/ml，抗CD28抗體的終濃度為20_80ng/ml ;所述步驟(m)細胞數量擴增的倍數是2-5倍；所述步驟(m)中IL-2的終濃度為50_200U/ml，IL-15的終濃度為20_100ng/ml ；所述培養基為RPMI-1640培養基、DMEM培養基或者AIM-V培養基。
全文摘要
本發明公開了一種以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的培養、冷凍及復蘇方法，可以解決患者為連續使用活化的CD3+CD8+為主的淋巴細胞而需多次采血的問題。其包括(1)通過將外周血樣提取出的淋巴細胞與IL-2，IL-15，抗CD3抗體，抗CD28抗體接觸，以擴增活化的以CD3+CD 8+為主活化淋巴細胞；(2)活化淋巴細胞的凍存；(3)活化淋巴細胞的復蘇。本發明所培養的活化淋巴細胞成分清晰，CD4+CD25+Treg細胞含量極少，并含有大量的CD8+T淋巴細胞，可以根據病人其他治療如放療化療來調整活化淋巴細胞的回輸時間和次數，以更好的治療腫瘤，感染性疾病以及免疫缺陷癥等疾病。
文檔編號C12N5/0783GK102839153SQ20121033958
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者高恒亮, 郭棟 申請人:濟南泰生生物技術有限公司