一種利用納豆芽孢桿菌生產維生素K₂的方法

專利名稱：一種利用納豆芽孢桿菌生產維生素K₂的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產維生素K2的方法，特別涉及一種利用納豆芽孢桿菌生產維生素1(2的方法。
背景技術：
維生素K (MK)是一類含有甲蔡醒結構的抗出血性化合物的總稱，又名為凝血維生素或抗出血維生素。維生素K (MK)可分為兩大類，一類為脂溶性化合物KpK2和K3，可在動植物體內提取；另一類為水溶性化合物K4,人工化學合成。最重要的為I、K2和K3，商品用維生素K是維生素K3的衍生物。在動物體內，具有生物活性的是K2,而維生素K1和K3需要在肝臟內轉化為K2才能發揮功能。維生素K2不僅在血液凝固過程中，在骨骼代謝上也有著重要作用，已被廣泛用于 骨質疏松等疾病的預防和治療。維生素K2是腸道群細菌的代謝產物，在發酵過程后的某些食品中有少量的維生素K2，發酵納豆食品中維生素K2含量尤其豐富。文獻報道指出目前能夠用于發酵生產MK的菌種主要是革蘭氏陰性菌的產黃桿菌和屬于革蘭氏陽性菌的納豆芽孢桿菌。Yoshinori T等和Toshiro S等發現分別對納豆中分離的芽孢桿菌進行誘變處理后可以提高維生素K的產量。原生質體融合起源于20世紀60年代，并于70年代逐漸發展起來的重要基因重組技術。是通過酶或機械的方法除去細胞壁，使雙親株的微生物菌體細胞形成球狀原生質體，經過物理、化學或生物方法使雙親株的原生質體融合，再發生染色體基因組間的交換重組，使融合子具有雙親的優勢性狀，在適宜的培養條件下再生細胞壁，經過合理的篩選，從再生菌體中獲得重組子。近年來，該技術已成為細胞生物學研究領域迅速發展的方向之一。該技術不僅能夠改良菌種遺傳性狀、提升有用代謝產物產量，還能綜合不同菌株的代謝特性，產生新的有用代謝產物，在工業生產和遺傳育種上展示出美好的應用前景。實踐證明，利用原生質體融合技術可以獲得具有雙親優良特性的融合子，并且細菌之間的原生質體融合可以克服細菌種屬之間的差異而實現基因重組。谷吉樹等試驗了甘油、葡萄糖、果糖和可溶性淀粉等十幾種碳源對產黃桿菌生產MK的影響，發現以甘油為碳源的培養基中MK的含量最高。納豆芽孢桿菌發酵時，盡管以蔗糖為碳源細胞增長最快，但以甘油為碳源時MK的產量最高。以大豆提取物為氮源時，MK-7產量最高，而且由于大豆提取物是納豆加工的副產物，因此價格也很便宜，是一種理想的氮源。酵母膏不適合單獨作氮源，但在另外加有氮源后，適當添加酵母膏會增加MK產量。無機鹽中，K2HPO4對MK特別是MK-4的影響很大，產黃桿菌發酵時需加入K2HP04、MgS04和NaCl，但是枯草桿菌的培養基中只需加入Κ2ΗΡ04。因此，特別需要一種利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，以解決上述現有存在的問題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，針對現有技術的不足，提高了維生素K2的產量，為實現維生素K2規模化生產提供了有效方法。本發明所解決的技術問題可以采用以下技術方案來實現一種利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，它包括如下步驟(I)用納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質體融合后篩選獲得的高產菌株BKU-6 ；(2)納豆芽孢桿菌菌株BUK-6復合后，接種于20ml的種子培養液中進行恒溫培養，再接種5%的活化培養基于IOOml發酵培養基中進行發酵；
(3)發酵液中加入異丙醇和正已烷混合物處理，處理后進行離心處理，取上清液過濾；(4)濾液經揮發后即可得到維生素K2的油狀物，經過真空冷凍干燥后即可得到黃褐色維生素K2的成品。在本發明的一個實施例中，所述納豆芽孢桿菌BS-5是合肥工業大學食品學院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供。在本發明的一個實施例中，所述納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質體之間采用電融合方式進行融合。在本發明的一個實施例中，所述種子培養液為完全培養基，它包括如下質量百分比的組分蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量為水。在本發明的一個實施例中，所述恒溫培養的溫度為37°C，時間為12h。在本發明的一個實施例中，所述發酵培養基包括如下質量百分比的組分甘油5%,大豆提取物 3%,酵母粉 O. 6g/L, K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2Η200· lg/L 和 MgSO4 · 7H200. 3g/L，余量為水。在本發明的一個實施例中，所述發酵的溫度為37°C，時間為4d。 在本發明的一個實施例中，所述異丙醇和正已烷混合物中異丙醇和正已烷的體積比為I :2，處理方式為在搖床上以220r/min的速度震蕩lOmin，用于提取納豆芽孢桿菌發酵液中的維生素K2。在本發明的一個實施例中，所述離心處理的離心時間為15min，離心速率為8000rmpo本發明的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，與現有技術相比，通過高產維生素K2的納豆芽孢桿菌BS-53與生長速度快但維生素K產量低的納豆芽孢桿菌CICC10262進行原生質體融合，篩選具有雙親優勢的融合子，利用獲得的高產而且生長速度快的高產菌株在優化的發酵條件下生產維生素K2,并用異丙醇和正己烷來提取分離維生素K2,提高了菌種的生長速度和維生素K2的產量，為實現維生素K2規模化生產提供了有效方法，實現本發明的目的。本發明的特點可參閱以下較好實施方式的詳細說明而獲得清楚地了解。
具體實施例方式為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面進一步闡述本發明。本發明的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，它包括如下步驟(I)用納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質體融合后篩選獲得的高產菌株BKU-6 ；(2)納豆芽孢桿菌菌株BUK-6復合后，接種于20ml的種子培養液中進行恒溫培養，再接種5%的活化培養基于IOOml發酵培養基中進行發酵；(3)發酵液中加入異丙醇和正已烷混合物處理，處理后進行離心處理，取上清液過濾；(4)濾液經揮發后即可得到維生素K2的油狀物，經過真空冷凍干燥后即可得到黃褐色維生素K2的成品。 在本發明中，所述納豆芽孢桿菌BS-5是合肥工業大學食品學院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供；所述納豆芽孢桿菌BS-5菌株是一種從自然界中分離的可以產MK的革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌,但是產量比較低；納豆芽孢桿菌CICC 10262是一種MK產量低但生長速度快的菌株；納豆芽孢桿菌BS-53是納豆芽孢桿菌BS-5菌株誘變處理后MK產量高但生長速度慢的菌株。在本發明中，所述納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質體之間采用電融合方式進行融合。在本發明中，所述種子培養液為完全培養基，它包括如下質量百分比的組分蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量為水；所述恒溫培養的溫度為37°C，時間為12h。在本發明中，所述發酵培養基包括如下質量百分比的組分甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉 O. 6g/L, K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2H20 O. lg/L 和 MgSO4 · 7H20 0. 3g/L，余量為水；所述發酵的溫度為37°C，時間為4d。在本發明中，所述異丙醇和正已烷混合物中異丙醇和正已烷的體積比為I :2，處理方式為在搖床上以220r/min的速度震蕩lOmin，用于提取納豆芽孢桿菌發酵液中的維生
素K2。在本發明中，所述離心處理的離心時間為15min，離心速率為8000rmp。實施例菌種復蘇菌種BS-5和CICC10262復壯后，接種于斜面固體培養基上，37°C恒溫培養18_24h,置于4°C保存。種子培養活化菌種接入液體培養基中(30/250ml)，37 °C，120r/min恒溫培養48h。取種子培養液，按5%的接種量(v/v)接入到液體培養基中(30/250ml)，37°C，120r/min
恒溫培養。BS-5菌株的紫外誘變BS-5菌對數生長早期的菌懸液，于3500R/min離心收集菌體，用滅菌生理鹽水洗滌菌體2-3次后，制成細胞濃度為I X 108個/mL的菌懸液。在超凈工作臺上，吸取15mL菌懸液于直徑9cm的無菌培養皿中，調整培養皿至紫外燈(20W)的垂直距離為30cm。在紫外燈下照射45s后，連續處理兩代，將菌液涂布于抗性平板，37 °C恒溫培養箱中避光培養24h，篩選得到BS-52菌。BS-5菌株的紫外誘變取BS-52菌懸液9ml，加入亞硝基弧溶液1ml，使其在菌懸液中的終濃度達到100ug/ml，置于37°C恒溫振蕩30min，取出菌懸液8000r/min離心IOmin,棄去上清液，用生理鹽水洗滌2-3次，再用IOml液體培養基懸浮菌體，于37°C培養24h。制備的菌懸液，適當稀釋，取O. Iml涂布抗性平板，37°C恒溫培養箱中避光培養24h，篩選得到BS-53菌。BS-53菌和CICC10262原生質體制備將2%活化菌株CICC10262接種到20mL新鮮完全培養基中，37°C振蕩培養至對數生長前期，加入青霉素O. 6U/mL繼續培養約2h，取菌液，離心lOmin，棄去上清液，用磷酸緩沖液洗2次，再懸浮于高滲緩沖液(SMM)中。加入溶菌酶I. Omg/mL于37°C保溫lh，每隔一段時間在倒置顯微鏡下觀察是否有原生質體生成，當鏡檢有90%的原生質體形成時，3000r/mim離心lOmin，棄上清液，沉淀用高滲緩沖液(SMM)洗滌2次以除酶，最終懸浮于SMM中。將2%活化菌株BS-53菌接種到20mL新鮮完全培養基中，37°C振蕩培養至對數生長前期，加入青霉素2U/mL繼續培養約2h，取菌液，離心lOmin，棄去上清液，用磷酸緩沖液洗2次，再懸浮于高滲緩沖液(SMM)中。加入溶菌酶I. 4mg/mL于37°C保溫40min，每隔一段時間在倒置顯微鏡下觀察是否有原生質體生成，當鏡檢有90%的原生質體形成時，3000R/ mim離心lOmin，棄上清液，沉淀用SMM洗滌2次，懸浮于SMM中。原生質體電融合BS_53菌(熱滅活法)和CICC10262菌株(紫外滅活法)分別經過滅活后，取兩親本滅活原生質體懸液各2ml，以I: I等量混合于滅菌離心管中，用SMM離心洗滌2次(3500r/min，IOmin)，并用電擊緩沖液離心洗滌一次，之后懸浮于電擊液中，調整原生質體濃度為108個/ml。用無菌移液器取少量混合懸液注入Icm的融合電極小室中，置于倒置顯微鏡下，之后接通電融合儀，先接通成串電壓和電流，調整電壓的大小，當電極小室中的原生質體在電壓的作用下逐漸形成串珠狀時，維持電壓幾分鐘，使其形成穩定的串珠狀。再接通直流融合電壓，直流脈沖可瞬間可逆擊穿相鄰的原生質體膜，從而觸發相鄰原生質體的融合。將融合小室取出，放入超凈工作臺內，靜置約5-10min，將電融合液用微量移液器接種于再生培養基上，于37°C培養4d,并從再生培養基上分離融合子。融合子的篩選選擇再生平板上生長速度快、菌落直徑大的單菌落，進行維生素K2高產菌株的初步篩選；淘汰菌落偏小、生長速度慢、易老化的菌落。將初篩菌株接種于液體復篩培養基中，37°C，200r/min培養4d，以MK產量作為篩選指標，同時以出發菌株作為對照，進一步篩選即可獲得MK產量最高的融合菌株BUK-6。納豆芽孢桿菌發酵培養納豆芽孢桿菌BUK-6接種至3L液體完全培養基(蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量為水)中，在恒溫搖床上，180rmp，37°C 條件下培養 10_12h。向3(T60L種子罐中加入無菌種子培養基(甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉O. 6g/L，K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2H20 O. lg/L 和 MgSO4 · 7Η200· 3g/L，余量為水)，種子灌液的滅菌溫度121°C，時間為15min，冷卻至37°C ;將納豆芽孢桿菌BUK-6活化菌液接種至種子罐中，溫度控制在37°C左右，罐壓為O. 5kg/cm2，種子罐轉速為180-220轉/分，通風量為10m3/h，生產周期4d。第九步維生素K2的分離純化發酵液中加入異丙醇和正已燒混合物,在搖床上220r/min震蕩IOmin后,8000rmp離心15min,取上清液過濾。
維生素K2的濃縮干燥濾液經揮發后即可得到維生素K2的油狀物，經過真空冷凍干燥后即可得到黃褐色維生素K2的成品。以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內，本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
權利要求
1.一種利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，它包括如下步驟 (1)用納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質體融合后篩選獲得的高產菌株BKU-6 ； (2)納豆芽孢桿菌菌株BUK-6復合后，接種于20ml的種子培養液中進行恒溫培養，再接種5%的活化培養基于IOOml發酵培養基中進行發酵； (3)發酵液中加入異丙醇和正已烷混合物處理，處理后進行離心處理，取上清液過濾； (4)濾液經揮發后即可得到維生素K2的油狀物，經過真空冷凍干燥后即可得到黃褐色維生素K2的成品。
2.如權利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，所述納豆芽孢桿菌BS-5是合肥工業大學食品學院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供。
3.如權利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，所述納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質體之間采用電融合方式進行融合。
4.如權利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，所述種子培養液為完全培養基，它包括如下質量百分比的組分蛋白胨1%，葡萄糖0. 5%，酵母粉0. 5%,牛肉膏0. 5%和NaCl 0. 5%,余量為水。
5.如權利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，所述恒溫培養的溫度為37°C，時間為12h。
6.如權利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，所述發酵培養基包括如下質量百分比的組分甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉0. 6g/L，K2HPO40.3mol/L, CaCl2 2H20 0. lg/L 和 MgSO4 7H20 0. 3g/L，余量為水。
7.如權利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，所述發酵的溫度為37°C，時間為4d。
8.如權利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，所述異丙醇和正已烷混合物中異丙醇和正已烷的體積比為I :2，處理方式為在搖床上以220r/min的速度震蕩lOmin，用于提取納豆芽孢桿菌發酵液中的維生素K2。
9.如權利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，其特征在于，所述離心處理的離心時間為15min,離心速率為8000rmp。
全文摘要
本發明的目的在于公開一種利用納豆芽孢桿菌生產維生素K2的方法，通過高產維生素K2的納豆芽孢桿菌BS-53與生長速度快但維生素K產量低的納豆芽孢桿菌CICC10262進行原生質體融合，篩選具有雙親優勢的融合子，利用獲得的高產而且生長速度快的高產菌株在優化的發酵條件下生產維生素K2，并用異丙醇和正己烷來提取分離維生素K2，提高了菌種的生長速度和維生素K2的產量，為實現維生素K2規模化生產提供了有效方法，實現本發明的目的。
文檔編號C12P7/66GK102808005SQ20121033941
公開日2012年12月5日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者劉國慶, 趙肖, 胡衛華, 錢曉勇 申請人:上海紅馬飼料有限公司