專利名稱：丁二酸的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種丁二酸的制備方法。
背景技術：
丁二酸又稱琥珀酸(Succinic acid)，屬于二元羧酸，是一種常見的天然有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。作為一種重要的C4平臺化合物，丁二酸在醫藥、食品以及表面活性劑等行業有著廣泛的用途，是一種重要的化工原料。丁二酸可作為合成復雜有機化合物的中間體，也可以用于合成大宗化學品以及生物可降解材料，因此丁二酸被認為是繼檸檬酸后最具市場潛力的發酵有機酸產品。
發明內容
本發明提出一種丁二酸的制備方法，所述制備方法包括A)提供含有纖維素的生物質；B)對所述生物質進行水解以得到含有纖維二糖的水解液；和C)以所述水解液作為碳源，利用丁二酸生產菌發酵得到丁二酸。根據本發明實施例的丁二酸的制備方法通過水解含有纖維素的生物質，從而可以得到以纖維二糖為主要成分的水解液(所述水解液還可以包含葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等)。以所述水解液作為碳源，利用丁二酸生產菌發酵生產丁二酸不僅可以降低丁二酸的生產成本，而且可以有效地利用生物質資源。而且，由于將所述生物質中的纖維素降解為二糖而不是單糖，從而可以進一步降低丁二酸的生產成本。根據本發明的一個實施例，所述步驟B)包括B_1)將所述生物質粉碎至預定大小；B_2)利用硫酸對所述生物質進行酸解，然后過濾并得到酸解后的殘渣；和B-3)向所述殘渣中加入水和纖維素酶以對所述殘渣進行酶解，過濾得到含有纖維二糖的所述水解液。根據本發明的一個實施例，在所述步驟B-1)中，粉碎后的所述生物質過40目篩。由此可以進一步便于對所述生物質進行酸解。根據本發明的一個實施例，所述硫酸的濃度為1% -10%且所述生物質與所述硫酸的體積比為I :3_7，所述酸解在100攝氏度一 140攝氏度的條件下進行I小時-3小時。這樣可以充分地對所述生物質進行酸解。根據本發明的一個實施例，所述酶解在PH4-6以及40攝氏度_60攝氏度的條件下進行60小時-90小時。由此可以充分地對所述殘渣進行酶解以得到盡可能多的纖維二糖。根據本發明的一個實施例，所述殘渣與所述水的體積比為I :3_5，所述纖維素酶的濃度為10-30IU/克殘渣。由此可以充分地對所述殘渣進行酶解以得到盡可能多的纖維二糖。根據本發明的一個實施例，所述步驟C)包括C-1)對所述丁二酸生產菌進行活化；c_2)在種子培養基中培養活化后的所述丁二酸生產菌以得到種子液；和C-3)將所述種子液接種到以所述水解液作為碳源的發酵培養基中進行發酵以得到丁二酸。根據本發明的一個實施例，在所述步驟C-3)中，所述種子液的接種量為3% -10%，所述發酵在厭氧條件下進行30小時一 40小時，溫度為35攝氏度一 40攝氏度，pH6. 5-7. 0，攪拌速度為100轉/分鐘-300轉/分鐘。根據本發明的一個實施例，所述生物質選自玉米芯、秸桿和甘蔗渣中的一種或多種。這樣可以利用廢棄的生物質資源，達到綠色、環保、節能的社會經濟效益。根據本發明的一個實施例，所述丁二酸生產菌為產琥珀酸放線桿菌(ActinobaciIlus succinogenes ) NJl 13。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖
中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。下面描述根據本發明實施例的丁二酸的制備方法。根據本發明實施例的丁二酸的 制備方法包括
A)提供含有纖維素的生物質；
B)對所述生物質進行水解以得到含有纖維二糖的水解液；和
C)以所述水解液作為碳源，利用丁二酸生產菌發酵得到丁二酸。根據本發明實施例的丁二酸的制備方法通過水解含有纖維素的生物質，從而可以得到以纖維二糖為主要成分的水解液(所述水解液還可以包含葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等)。以所述水解液作為碳源，利用丁二酸生產菌發酵生產丁二酸不僅可以降低丁二酸的生產成本，而且可以有效地利用生物質資源。而且，由于將所述生物質中的纖維素降解為二糖而不是單糖，從而可以進一步降低丁二酸的生產成本。具體地，所述水解液中含有的纖維二糖占所述水解液中總糖量的50% -60% (重量百分比，以下同)，所述水解液中含有的葡萄糖占所述水解液中總糖量的15% -25%、所述水解液中含有的阿拉伯糖占所述水解液中總糖量的10% _20%、所述水解液中含有的木糖占所述水解液中總糖量的5% -10%。具體而言，所述生物質可以是廢棄的生物質。例如，所述生物質可以選自玉米芯、秸桿和甘蔗渣中的一種或多種。通過利用廢棄的生物質來生產丁二酸，從而可以利用廢棄的生物質資源，達到綠色、環保、節能的社會經濟效益。為了便于對所述生物質進行酸解，可以先將所述生物質粉碎至預定大小。有利地，可以將粉碎后的所述生物質過40目篩，由此可以進一步便于對所述生物質進行酸解。然后，可以對過40目篩的所述生物質進行清洗和烘干。在本發明的一些實施例中，可以利用硫酸對所述生物質進行酸解。由此可以更加有效地對所述生物質進行酸解。具體地，所述硫酸的濃度可以是I %-10% (體積比，以下同)。優選地，所述硫酸的濃度可以是進一步優選地，所述硫酸的濃度可以是2 %。所述生物質與所述硫酸的體積比可以是I :3_7，這樣可以充分地對所述生物質進行酸解。優選地，所述生物質與所述硫酸的體積比可以是I :4-6。進一步優選地，所述生物質與所述硫酸的體積比可以是I :5。所述酸解可以在100攝氏度一 140攝氏度的條件下進行I小時-3小時，這樣可以充分地對所述生物質進行酸解。優選地，所述酸解可以在110攝氏度一 130攝氏度的條件下進行I. 5小時-2. 5小時。進一步優選地，所述酸解可以在121攝氏度的條件下進行2小時。所述酸解結束后可以進行過濾并去除上清液以得到酸解后的殘渣，然后可以對所述殘渣進行清洗和烘干。隨后，可以向所述殘渣中加入水和纖維素酶以對所述殘渣進行酶解。其中，所述殘渣與所述水的體積比可以是I :3_5，所述纖維素酶的濃度可以是10-30IU/克殘渣。優選地，所述殘渣與所述水的體積比可以是I :4，所述纖維素酶的濃度可以是15-20IU/克殘渣。其中，所述纖維素酶可以是Celluclast 1.5 L (諾維信，丹麥)，其中僅有微量的P _葡糖苷酶。在本發明的一些示例中，所述酶解可以在pH4-6以及40攝氏度-60攝氏度的條件下進行60小時-90小時，由此可以充分地對所述殘渣進行酶解以得到盡可能多的纖維二 糖。優選地，所述酶解可以在pH4. 5-5. 5以及45攝氏度-55攝氏度的條件下進行70小時-85小時。進一步優選地，所述酶解可以在pH5. 0以及50攝氏度的條件下進行75小時-85小時。所述酶解結束后可以進行過濾以得到含有纖維二糖的所述水解液。具體地，所述水解液還可以包含葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等。可以利用產玻拍酸放線桿菌(ActinobaciIlussuccinogenes ) NJl 13 (CGMCCNO. 1716)發酵生產丁二酸。其中，該產琥珀酸放線桿菌NJl 13已申請專利并獲得授權，專利授權公告號為CN100537744C。可以利用現有的方法對該產琥珀酸放線桿菌NJ113進行發酵。在本發明的一個示例中，所述步驟C)可以包括
C-I)對所述丁二酸生產菌進行活化；
C-2)在種子培養基中培養活化后的所述丁二酸生產菌以得到種子液；和
C-3)將所述種子液接種到以所述水解液作為碳源的發酵培養基中進行發酵以得到丁二酸。具體而言，可以在斜面培養基上對產琥珀酸放線桿菌NJ113進行活化。具體地，產琥珀酸放線桿菌NJ113在斜面培養基上進行劃線后，可以在厭氧培養箱中在37攝氏度的條件下活化培養24小時。其中，所述斜面培養基的配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，玉米漿5g/L，NaHCO3 10g/L，二水合磷酸二氫鈉9. 6g/L，三水合磷酸氫二鉀15. 5g/L，瓊脂20g/L，pH7. 0，121攝氏度滅菌15分鐘。然后可以將活化后的產琥珀酸放線桿菌NJl 13轉接到種子培養基中，充入二氧化碳2分鐘-3分鐘，在30攝氏度-40攝氏度的條件下培養10小時-12小時。其中，所述種子培養基的配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，二水合磷酸二氫鈉9.6g/L，三水合磷酸氫二鉀15. 5g/L，碳酸氫鈉10g/L，玉米漿5g/L，pH 7. 0，121攝氏度滅菌15分鐘。將活化好的種子液接入到發酵培養基中，所述種子液的接種量為3% -10% (體積比)，所述發酵在厭氧條件下進行30小時一 40小時，溫度為35攝氏度一 40攝氏度，pH6. 5 一
7.0，攪拌速度為100轉/分鐘-300轉/分鐘。在發酵過程中可以始終向發酵培養基中通入二氧化碳以保持厭氧環境。所述發酵培養基的配方為碳源30g/L，乙酸鈉1.36g/L，氯化鈉lg/L，氯化鈣0. 2g/L，氯化鎂0. 2g/L，磷酸氫二鈉0. 31g/L，磷酸二氫鈉I. 6g/L，磷酸氫二鉀15.5g/L，酵母膏10g/L，pH 7. O，121攝氏度滅菌15分鐘。其中，所述碳源為所述水解液，所述水解液中含有的纖維二糖占所述水解液中總糖量的50% -60% (重量百分比，以下同)，所述水解液中含有的葡萄糖占所述水解液中總糖量的15% _25%、所述水解液中含有的阿拉伯糖占所述水解液中總糖量的10 % -20%、所述水解液中含有的木糖占所述水解液中總糖量的5% -10%。
實施例I
取一定量的甘蔗渣，洗凈并烘干，對甘蔗渣進行粉碎并過40目篩。然后向甘蔗渣加入濃度為1%的硫酸以對甘蔗渣進行酸解，酸解在100攝氏度的條件下進行3小時。其中，甘蔗渣與硫酸的體積比為1:7。
酸解結束后進行過濾，去除上清液以得到殘渣，對殘渣進行清洗和烘干。然后，向殘渣中加入水和纖維素酶以對殘渣進行酶解，酶解在PH4以及40攝氏度的條件下進行90小時。其中，殘渣與水的體積比為I :3，纖維素酶的濃度為30IU/克殘渣。酶解結束后進行過濾以得到上清液，該上清液就是含有纖維二糖的水解液。其中，水解液可以含有50% -60%的纖維二糖、15% -25%的葡萄糖、10% -20%的阿拉伯糖和5% -10%的木糖。該水解液115攝氏度滅菌15分鐘后作為碳源備用。將產琥珀酸放線桿菌NJl 13在斜面培養基上進行劃線后，放入厭氧培養箱中在37攝氏度的條件下活化培養24小時。其中，斜面培養基的配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，玉米漿5g/L，NaHCO3 10g/L，二水合磷酸二氫鈉9. 6g/L，三水合磷酸氫二鉀15. 5g/L，瓊脂20g/L，pH7. 0，121攝氏度滅菌15分鐘。然后將活化后的產琥珀酸放線桿菌NJl 13轉接到種子培養基中，充入二氧化碳2分鐘-3分鐘，在30攝氏度-40攝氏度的條件下培養10小時-12小時。其中，種子培養基的配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，二水合磷酸二氫鈉9.6g/L，三水合磷酸氫二鉀15. 5g/L，碳酸氫鈉10g/L，玉米漿5g/L，pH 7. 0，121攝氏度滅菌15分鐘。將活化好的種子液接入到發酵培養基中，種子液的接種量為3%，發酵在厭氧條件下進行40小時，溫度為40攝氏度，pH6. 5，攪拌速度為300轉/分鐘。在發酵過程中始終向發酵培養基中通入二氧化碳以保持厭氧環境。發酵培養基的配方為碳源35g/L，乙酸鈉
I.36g/L，氯化鈉lg/L，氯化鈣0. 2g/L，氯化鎂0. 2g/L，磷酸氫二鈉0. 31g/L，磷酸二氫鈉1.6g/L，磷酸氫二鉀15. 5g/L，酵母膏10g/L，pH 7. 0，121攝氏度滅菌15分鐘。其中，碳源為本實施例得到的水解液，纖維二糖為18g/L。發酵結果見表I。實施例2
取一定量的玉米芯，洗凈并烘干，對玉米芯進行粉碎并過40目篩。然后向玉米芯加入濃度為10%的硫酸以對玉米芯進行酸解，酸解在140攝氏度的條件下進行I小時。其中，玉米芯與硫酸的體積比為1:3。酸解結束后進行過濾，去除上清液以得到殘渣，對殘渣進行清洗和烘干。然后，向殘渣中加入水和纖維素酶以對殘渣進行酶解，酶解在PH6以及60攝氏度的條件下進行60小時。其中，殘渣與水的體積比為I :5，纖維素酶的濃度為10IU/克殘渣。酶解結束后進行過濾以得到上清液，該上清液就是含有纖維二糖的水解液。其中，水解液可以含有50% -60%的纖維二糖、15% -25%的葡萄糖、10% -20%的阿拉伯糖和5% -10%的木糖。該水解液115攝氏度滅菌15分鐘后作為碳源備用。利用實施例I中的方法活化產琥珀酸放線桿菌NJ113并制備產琥珀酸放線桿菌NJ113的種子液。將活化好的種子液接入到發酵培養基中，種子液的接種量為10%,發酵在厭氧條件下進行30小時，溫度為35攝氏度，pH7，攪拌速度為100轉/分鐘。在發酵過程中始終向發酵培養基中通入二氧化碳以保持厭氧環境。本實施例中的發酵培養基僅碳源不同于實施例I的發酵培養基。其中，碳源為本實施例得到的水解液，纖維二糖為16g/L。發酵結果見表I。實施例3
取一定量的水稻秸桿，洗凈并烘干，對水稻秸桿進行粉碎并過40目篩。然后向水稻秸 桿加入濃度為2%的硫酸以對水稻秸桿進行酸解，酸解在121攝氏度的條件下進行2小時。其中，水稻秸桿與硫酸的體積比為1:5。酸解結束后進行過濾，去除上清液以得到殘渣，對殘渣進行清洗和烘干。然后，向殘渣中加入水和纖維素酶以對殘渣進行酶解，酶解在PH5以及50攝氏度的條件下進行75小時。其中，殘渣與水的體積比為I :4，纖維素酶的濃度為20IU/克殘渣。酶解結束后進行過濾以得到上清液，該上清液就是含有纖維二糖的水解液。其中，水解液可以含有50% -60%的纖維二糖、15% -25%的葡萄糖、10% -20%的阿拉伯糖和5% -10%的木糖。該水解液115攝氏度滅菌15分鐘后作為碳源備用。利用實施例I中的方法活化產琥珀酸放線桿菌NJ113并制備產琥珀酸放線桿菌NJ113的種子液。將活化好的種子液接入到發酵培養基中，種子液的接種量為5%,發酵在厭氧條件下進行35小時，溫度為37攝氏度，pH6. 7，攪拌速度為200轉/分鐘。在發酵過程中始終向發酵培養基中通入二氧化碳以保持厭氧環境。本實施例中的發酵培養基僅碳源不同于實施例I的發酵培養基。其中，碳源為本實施例得到的水解液，纖維二糖為15g/L。發酵結果見表I。表I
權利要求
1.一種丁二酸的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括 A)提供含有纖維素的生物質； B)對所述生物質進行水解以得到含有纖維二糖的水解液；和 C)以所述水解液作為碳源，利用丁二酸生產菌發酵得到丁二酸。
2.根據權利要求I所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，所述步驟B)包括 B-I)將所述生物質粉碎至預定大小； B-2)利用硫酸對所述生物質進行酸解，然后過濾并得到酸解后的殘渣；和B-3)向所述殘渣中加入水和纖維素酶以對所述殘渣進行酶解，過濾得到含有纖維二糖的所述水解液。
3.根據權利要求2所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，在所述步驟B-I)中，粉碎后的所述生物質過40目篩。
4.根據權利要求2所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，所述硫酸的濃度為1% -10%且所述生物質與所述硫酸的體積比為I :3-7，所述酸解在100攝氏度一 140攝氏度的條件下進行I小時-3小時。
5.根據權利要求2所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，所述酶解在pH4-6以及40攝氏度-60攝氏度的條件下進行60小時-90小時。
6.根據權利要求2所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，所述殘渣與所述水的體積比為I :3-5，所述纖維素酶的濃度為10-30IU/克殘渣。
7.根據權利要求I所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，所述步驟C)包括 C-I)對所述丁二酸生產菌進行活化； C-2)在種子培養基中培養活化后的所述丁二酸生產菌以得到種子液；和 C-3)將所述種子液接種到以所述水解液作為碳源的發酵培養基中進行發酵以得到丁二酸。
8.根據權利要求7所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，在所述步驟C-3)中，所述種子液的接種量為3% -10%，所述發酵在厭氧條件下進行30小時一 40小時，溫度為35攝氏度一 40攝氏度，pH6. 5 - 7. 0，攪拌速度為100轉/分鐘-300轉/分鐘。
9.根據權利要求I所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，所述生物質選自玉米芯、秸桿和甘蔗渣中的一種或多種。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的丁二酸的制備方法，其特征在于，所述丁二酸生產菌為產玻拍酸放線桿菌succinogenes) NJ113。
全文摘要
本發明公開了一種丁二酸的制備方法。所述制備方法包括A)提供含有纖維素的生物質；B)對所述生物質進行水解以得到含有纖維二糖的水解液；和C)以所述水解液作為碳源，利用丁二酸生產菌發酵得到丁二酸。根據本發明實施例的丁二酸的制備方法不僅可以降低丁二酸的生產成本，而且可以有效地利用生物質資源。
文檔編號C12P19/14GK102796773SQ20121033936
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者姜岷, 徐蓉, 奚永蘭, 張九花, 戴文宇, 陳可泉 申請人:南京工業大學