專(zhuān)利名稱(chēng)：胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行胞內(nèi)勞森氏菌快速檢測(cè)的方法，并涉及一種用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌的試劑盒。
背景技術(shù)：
胞內(nèi)勞森氏菌iLawsonia intracellularis, LI)是引起豬增生性腸炎(porcine proliferative enteritis, PPE)的病原菌,該病是近年來(lái)新流行的，以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸細(xì)胞發(fā)生腺瘤樣增生為特征的接觸性傳染病。PPE對(duì)機(jī)體吸收營(yíng)養(yǎng)和轉(zhuǎn)化飼料能力造成根本性和持久性的破壞，是危害生長(zhǎng)肥育豬最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)該病導(dǎo)致發(fā)病豬日增重平均下降37% 42%，每增重I公斤體重飼料攝入量增加27% 37%，發(fā)病豬每頭損失5 8美元。PPE已在全球豬場(chǎng)流行，發(fā)病率有升高 的趨勢(shì)，是目前豬場(chǎng)主要腸道性疾病之一。PPE的病原菌胞內(nèi)勞森氏菌(LI)，具有革蘭氏陰性菌的胞壁結(jié)構(gòu)和原核生物的胞漿結(jié)構(gòu)，外層細(xì)胞壁由3層波紋狀膜所組成，革蘭氏染色陰性，抗酸染色陽(yáng)性，能被Levaditi Silver或Warthin—Starry鍍銀染色法著色,用改良的Ziehl—Neelsen染色法細(xì)菌被染成紅色。胞內(nèi)勞森氏菌微需氧，不產(chǎn)芽胞，基因組已測(cè)序，基因組序列全長(zhǎng)1719350bp，編碼閱讀框(ORF)共1346個(gè)，GC含量?jī)H33%左右。不同動(dòng)物來(lái)源的胞內(nèi)菌可能是相同病原。現(xiàn)有的胞內(nèi)勞森氏菌檢測(cè)方法除了對(duì)病變腸道進(jìn)行組織學(xué)檢查外，主要還有免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法，這些方法各有優(yōu)勢(shì)，但也有不足，或所需時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、或步驟繁瑣、或成本較高。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由T. Notomi等發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)(Notomi,T.，et al.，Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic AcidsRes. 2000，28，e63.)，該技術(shù)依賴(lài)4條特異設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列，方法方便、成本低，尤其適于臨場(chǎng)檢測(cè)，應(yīng)用性強(qiáng)。近年來(lái)，國(guó)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)。目前尚未見(jiàn)有應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，建立檢測(cè)引起豬增生性腸炎的病原菌一胞內(nèi)勞森氏菌的方法及其試劑盒，解決現(xiàn)有檢測(cè)步驟繁瑣、成本較高、不適于臨場(chǎng)檢測(cè)的問(wèn)題，提供一種使用儀器簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)快速、敏感，適于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法及其試劑盒，從而為現(xiàn)代生豬養(yǎng)殖中的疾病診斷提供指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，包括以下成分
(I)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液
包括0.2 μΜ的上游外引物、0.2 μΜ的下游外引物、I.6 μΜ的上游內(nèi)引物、I.6 μ M的下游內(nèi)引物、I M甜菜堿、6 mM硫酸鎂、1.6mM dNTP、10XThermopol反應(yīng)緩沖液，其中引物序列為
上游外引物 F3 :5’ -AGCTAACGCGTTAAGCACC-3’
下游外引物 B3 :5’ -CTTAACCCAACACCTCACGG-3’
上游內(nèi)引物 FIP :5’ -CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3’ 下游內(nèi)引 BIP 5’-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3’
(2)聚合酶每微升為8個(gè)活性單位的BstDNA聚合酶；
(3)顯色劑SYBRGreen I熒光染料。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是 一種胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌的方法，包括以下步驟
(1)待檢樣品DNA的提取
提取待檢樣品胞內(nèi)勞森氏菌的DNA，其中提取的樣品DNA在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)，其OD260/OD280應(yīng)在I. 6 2. O范圍內(nèi)，濃度應(yīng)在10 IOOng/ μ L范圍內(nèi)；
(2)胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
Α.在反應(yīng)管中建立18 μ L的LAMP反應(yīng)液；
B.向上述反應(yīng)管中加入IyL8U的Bst DNA聚合酶和Iy L胞內(nèi)勞森氏菌DNA模板；
C.將上述反應(yīng)管置于水浴渦中65°C恒溫?cái)U(kuò)增60min ；
D.將水浴溫度調(diào)到80°C放置2min從而終止反應(yīng)，3 5min后取出待檢；
(3)顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入I UL的SYBR GreenI染料，室溫放置，肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說(shuō)明待檢樣品中含有胞內(nèi)勞森氏菌，反應(yīng)液顏色變?yōu)辄S色，則說(shuō)明待檢樣品中不含有胞內(nèi)勞森氏菌。本發(fā)明的有點(diǎn)在于本發(fā)明是根據(jù)胞內(nèi)勞森氏菌16SrRNA基因中較為保守的六個(gè)序列片段設(shè)計(jì)的兩個(gè)特異性?xún)?nèi)引物和兩個(gè)特異性外引物，該保守基因序列為胞內(nèi)勞森氏菌所共有的，以保證檢測(cè)不同來(lái)源的胞內(nèi)勞森氏菌的可靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)，比PCR技術(shù)更為敏感，但不需要昂貴的PCR儀，只需要普通的水浴渦即可，且反應(yīng)結(jié)果不需要電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察，使用熒光染料肉眼觀察即可，簡(jiǎn)單、快速，特別適合用于基層臨床檢測(cè)?？傊?，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，因其具有敏感、特異、快速、可靠、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，使得它與其它診斷技術(shù)相比，更適合于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷。本發(fā)明建立的胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，可提高臨床診斷的速度和準(zhǔn)確性，且操作簡(jiǎn)單，成本低廉，適合基層使用，能有效診斷該菌引起的豬增生性腸炎病，該病得以控制后，將顯著提高生豬出欄率、降低生豬死亡率，提高生豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式 下列實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作為本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :
胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒組分的配制
(I)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液在配制LAMP反應(yīng)液前首先進(jìn)行擴(kuò)增弓I物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank公布的胞內(nèi)勞森氏菌的基因序列，在其序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)了 2對(duì)引物，引物序列為
上游外引物 F3 :5’ -AGCTAACGCGTTAAGCACC-3’
下游外引物 B3 :5’ -CTTAACCCAACACCTCACGG-3’
上游內(nèi)引物 FIP :5’ -CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3’ 下游內(nèi)引 BIP 5’-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3’
進(jìn)而配制反應(yīng)液，組分包括O. 2 μ M的上游外引物F3、0. 2 4 1的下游外引物83、1.6“] 的上游內(nèi)引物？1 、1.6 μ M的下游內(nèi)引物BIP、1 M甜菜堿、6 mM硫酸鎂、1.6mM dNTP、IOXThermopol反應(yīng)緩沖液；
(2)聚合酶每微升為8個(gè)活性單位的BstDNA聚合酶； (3)顯色劑=SYBRGreen I熒光染料。LAMP反應(yīng)液最佳體系為18 μ L,成分組成如下
O. 2μΜ的上游外引物F3 O. 4μ L.O. 2 μΜ的下游外引物Β3 O. 4μ LU. 6 μ M的上游內(nèi)引物FIP O. 5 μ L、l. 6 μ M的下游內(nèi)引物BIP O. 5 μ LU M甜菜堿5yL、6 mM硫酸鎂
O.3 μ L、I. 6mM dNTP 2· 5 μ L、10 X Thermopol 反應(yīng)緩沖液 2 μ L。實(shí)施例2 :利用胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌
(I)待檢樣品DNA的提取
樣品I為胞內(nèi)勞森氏菌(Zaff1SOflia intracellularis, LI),菌種來(lái)源龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所。樣品2為疑似豬增生性腸炎(porcine proliferative enteritis, PPE)的病料組織，病例來(lái)源龍巖市某豬場(chǎng)。采用購(gòu)至福州晶泰生物技術(shù)有限公司的DNA提取試劑盒對(duì)樣品I和樣品2進(jìn)行DNA的提取。其中提取的樣品DNA在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)，其0D26(i/0D28(i應(yīng)在I. 6 2. O范圍內(nèi)，濃度應(yīng)在10 IOOng/ μ L范圍內(nèi)。(2)胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
Α.在反應(yīng)管中建立18 μ L的LAMP反應(yīng)液；
B.向上述反應(yīng)管中加入IyL8U的Bst DNA聚合酶和Iy L胞內(nèi)勞森氏菌DNA模板；
C.將上述反應(yīng)管置于水浴渦中65°C恒溫?cái)U(kuò)增60min ；
D.將水浴溫度調(diào)到80°C放置2min從而終止反應(yīng)，3 5min后取出待檢；
(3)顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入I UL的SYBR GreenI染料，室溫放置，肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說(shuō)明待檢樣品中含有胞內(nèi)勞森氏菌，反應(yīng)液顏色變?yōu)辄S色，則說(shuō)明待檢樣品中不含有胞內(nèi)勞森氏菌。
(4)靈敏度試驗(yàn)
將胞內(nèi)勞森氏菌的DNA從10° 10_7進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)嫉臐舛葹?56 ng· μ L—1，稀釋成 95. 6 ng· μ L \9. 56 ng· μ L \956 pg· μ L \95. 6 pg· μ L \9. 56pg· μ L \956fg· μ L-1與95. 6fg· μ L-1，分別取I μ L進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的敏感性。試驗(yàn)結(jié)果表明，LAMP法測(cè)定胞內(nèi)勞森氏菌DNA模板的靈敏度可達(dá)到
95. 6 pg· μ L'
權(quán)利要求
1.一種胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括以下成分 (1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液 包括0.2 μΜ的上游外引物、0.2 μΜ的下游外引物、I.6 μΜ的上游內(nèi)引物、I.6 μ M的下游內(nèi)引物、I M甜菜堿、6 mM硫酸鎂、1.6mM dNTP、10XThermopol反應(yīng)緩沖液，其中引物序列為 上游外引物 F3 :5’ -AGCTAACGCGTTAAGCACC-3’ 下游外引物 B3 :5’ -CTTAACCCAACACCTCACGG-3’上游內(nèi)引物 FIP :5’ -CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3’ 下游內(nèi)引 BIP 5’-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3’ (2)聚合酶每微升為8個(gè)活性單位的BstDNA聚合酶； (3)顯色劑SYBRGreen I熒光染料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述LAMP反應(yīng)液體系為18 μ L，成分組成如下 O.2μΜ的上游外引物O. 4yL、0. 2 μ M的下游外引物O. 4 μ L、I. 6 μΜ的上游內(nèi)引物O.5μ LU. 6 μΜ 的下游內(nèi)引物 O. 5μ L、1 M 甜菜堿 5yL、6 mM 硫酸鎂 O. 3 μ L、L 6mM dNTP2· 5 μ L、10 X Thermopol 反應(yīng)緩沖液 2 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取 提取待檢樣品胞內(nèi)勞森氏菌的DNA，其中提取的樣品DNA在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)，其OD260/OD280應(yīng)在I. 6 2. O范圍內(nèi)，濃度應(yīng)在10 IOOng/ μ L范圍內(nèi)； (2)胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 Α.在反應(yīng)管中建立18 μ L的LAMP反應(yīng)液； B.向上述反應(yīng)管中加入IyL8U的Bst DNA聚合酶和Iy L胞內(nèi)勞森氏菌DNA模板； C.將上述反應(yīng)管置于水浴渦中65°C恒溫?cái)U(kuò)增60min ； D.將水浴溫度調(diào)到80°C放置2min從而終止反應(yīng)，3 5min后取出待檢； (3)顯色檢測(cè) 在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入I UL的SYBR GreenI染料，室溫放置，肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說(shuō)明待檢樣品中含有胞內(nèi)勞森氏菌，反應(yīng)液顏色變?yōu)辄S色，則說(shuō)明待檢樣品中不含有胞內(nèi)勞森氏菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法及其試劑盒。本發(fā)明試劑盒含有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液、BstDNA聚合酶和SYBRGreenI熒光染料顯色劑。利用試劑盒通過(guò)對(duì)樣品中DNA的提取、胞內(nèi)勞森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和顯色檢測(cè)三個(gè)環(huán)節(jié)，從而檢測(cè)出胞內(nèi)勞森氏菌。通過(guò)靈敏性試驗(yàn)證明，本方法可對(duì)95.6pg μL-1的DNA模板進(jìn)行高效擴(kuò)增，顯示出本方法高度的靈敏性。解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)步驟繁瑣、成本較高、不適于臨場(chǎng)檢測(cè)的問(wèn)題，提供了一種使用儀器簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)快速、敏感，適于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌的方法及其試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102839217SQ201210338260
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者黃翠琴, 楊小燕, 鄭新添, 尹會(huì)方 申請(qǐng)人:龍巖學(xué)院