專利名稱：一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學與材料學研究領域，具體涉及到以分子生物學對煙草花葉病毒殼蛋白模板進行結構修飾的方法。
背景技術：
煙草花葉病毒(TMV)是煙草花葉病得病原體，對煙葉生長危害極大，近年來，有研究者開始將TMV在材料研究領域進行應用。單個TMV病毒體具有納米管狀結構，該結構長300nm,內徑4nm,外徑18nm,是一種典型的具有一維納米結構的模板材 料。TMV外殼蛋白(CP)以其納米管狀的幾何外形、高活性的內外表面被認為是一種理想的構筑低維材料的模板(R. Tsukamoto, M. Muraoka, M. Seki, H. Tabata, I. Yamashita.Chem. Mater. , 2007, 19: 2389 ;Ε· Du jardin, C. Peet, G. Stubbs, J. N. Culver, S. Mann. NanoLett. , 2003, 3:413 ；M. Knez, M. Sumser, A. M. Bittner, C. ffege, H. Jeske, T. P. Martin, K.Kern. Adv. Funct. Mater.，2004, 14:116.),目前以 TMV-CP 為模板，已經進行了多種納米材料的生長，最終得到的復合材料被認為可在信息存儲、光捕集以及傳感器等領域有應用的潛力(R. J. Tseng, C. Tsai, L. Ma, J. Ouyang, C. S. Ozkan, Y. Yang. NatureNanotechnology, 2006, 1:72 ；R. A. Miller, A. D. Presley, Μ. B. Francis. J. Am. Chem.Soc. , 2007, 129 : 3104 ；T. L. Schlick, Z. Ding, E. ff. Kovacs, Μ. B. Francis. J. Am. Chem.Soc.，2005，127:3718)。一般來說，TMV-CP的組裝體在分散介質中存在三種可能的狀態(A. Klug. PhilosTrans R. Soc. London B, 1999，354:531) :1、蛋白A (可認為是單體、三聚體及五聚體之間的動態平衡);2、34個單體組成的盤狀結構；3、一定長度的中空管狀結構。調控體系pH值、離子強度以及溫度等條件，可以使得TMV-CP處于某幾種狀態的動態平衡中，這就使得TMV-CP在具體應用中呈現出結構的不連續性，不利于發揮其作為模板材料的功能。
發明內容
本發明的目的在于提供一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，以改善TMV-CP的結構均一性。為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，主要通過對His-TMV-CP表達質粒的構建、蛋白的表達及純化的方法進行結構的修飾，其殼蛋白模板結構修飾方法的具體步驟如下I) His-TMV-CP表達質粒的構建設計上游弓丨物TMVCP FI，和下游引物Hi s_TMV_CPRl，兩條引物被用來PCR擴增TMV外殼蛋白，PCR產物隨后經NdeI和NcoI雙酶切，使用T4DNA連接酶連接進入pET28a載體，將連接產物電轉化進入XLlBlue菌株，涂于LB瓊脂平板上；然后挑取潛在的陽性克隆進行擴增，提取質粒DNA，并送測序，在其羧基端含有His標簽的有確定DNA序列的His-TMV-CP質粒，隨后被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達；
2 ) Hi s-TMV-CP 蛋白的表達將含有宿主質粒的Rosetta原核表達菌株，置于含有100 μ g/mL氨節抗生素和25 μ g/mL氯霉素的LB培養基中，持續震蕩搖菌直至OD值達到O. 5-0. 6，此時細菌處于對數期，在誘導表達前，菌液在25°C條件下孵育4-6分鐘，取ImL菌液，離心，收取細菌保留以備進一步分析；然后加入誘導劑IPTG至濃度達到10 μ M，而后以SDS-PAGE分離細菌裂解液的方法評估蛋白表達情況，待蛋白表達達到最大值，收取全部菌液，將其重懸于裂解緩沖液中，低溫保存，以備進一步純化蛋白；3) HiS-TMV-CP 蛋白的純化將重懸細菌產物在常溫下解凍后,立即加入I. 5ml Buster試劑、30 μ I Lysonase試劑、5ml RNA酶和5ml DNA酶，在ImM (毫摩爾/升)的苯甲基磺酰氟濃度下將上述混合物在30°C，250rpm下震蕩20-40分鐘，加入30mL預冷的平衡緩沖液，冰浴4_6分鐘，以11000-13000g(轉速應該沒有此單位，請采用常用的單位來表示，如r/s)，4°C離心15-20分鐘，取上清與3mL已經平衡緩沖液沖洗的鎳樹脂充分混合，4°C轉動孵育過夜，隨后上蛋白純化柱進行純化；上柱純化時，首先使液體自然流出蛋白純化柱，直至無液體流出，在隨后的純化階段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脫柱子，然后分別以預冷緩沖液、沖洗緩沖液沖洗柱子，最后使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白，保存于_20°C。所述的步驟I)中兩條引物分別是上游引物TMVCP Fl,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl, TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTCo所述的步驟I)中PCR產物擴增的反應條件是解鏈溫度95°C，30秒，退火溫度
550C，30秒，延伸溫度68 °C，30秒，重復35個循環。所述的步驟3)中預冷緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，ImM PMSF, IOmM β -巰基乙醇，IOmM咪唑，10%乙醇，PH值8.0 ;沖洗緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，ImMPMSF, IOmM β -巰基乙醇，40mM咪唑，10%乙醇，PH值8. O ;洗脫緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，ImM PMSF，IOmM β -巰基乙醇，500mM咪唑，10%乙醇，PH值8. O。本發明以分子生物學的方法，將His標簽引入到TMV-CP中，His標簽之間以及His標簽與TMV-CP之間的強相互作用，改善TMV-CP的結構均一性，進而提高其作為模板材料的適用性，使得TMV-CP在介質較大的pH值、溫度以及離子強度范圍內，保持結構的穩定以及連續性，進而提高其作為模板材料的適用性，這將有望拓寬TMV-CP在材料領域的應用。
圖I為His-TMVCP的透射電鏡照片；·圖2為TMVCP的透射電鏡照片。由圖I、圖2可見，His-TMVCP在電鏡下為棒狀結構；而TMVCP除了有棒狀結構，還呈現出盤狀結構。
具體實施例方式下面本發明結合具體的實施例作進一步的說明實施例I
一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，其殼蛋白模板結構修飾方法的具體步驟如下I. His-TMV-CP表達質粒的構建兩條引物被用來擴增TMV外殼蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP F1,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl, TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC，反應條件如下解鏈溫度 95°C，30 秒，退火溫度 55°C，30秒，延伸溫度68°C，30秒，重復35個循環；PCR產物隨后經NdeI和NcoI雙酶切，使用T4DNA連接酶連接進入pET28a載體，將連接產物電轉化進入XLlBlue菌株，涂于含有100 μ g/mL氨芐的LB瓊脂平板上，37°C倒置孵育過夜，隨后，挑取3個潛在的陽性克隆進行擴增，提取質粒DNA，并送測序，在其羧基端含有His標簽的有確定DNA序列的His-TMV-CP質粒隨后被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達；
2. Hi s-TMV-CP 蛋白的表達 含有宿主質粒的Rosetta原核表達菌株在含有100 μ g/mL氨節抗生素和25 μ g/mL氯霉素的LB培養基中，在30°C，200rpm條件下持續震蕩搖菌；具體步驟如下從LB瓊脂平板上挑取單個克隆，接種于5mL培養基中，持續搖菌15小時至達到要求密度(從凍存的甘油保種菌液中挑菌，劃線于LB瓊脂平板，30°C倒置培養24小時)取ImL上述菌液培養基，接種于25mL培養基中，隨后在30°C條件下持續震蕩培養，至OD值達到O. 5，隨后，上述菌液全部接種于500mL培養基中，30°C條件下持續震蕩培養至OD值達到O. 5，在誘導表達前，菌液在25°C條件下孵育4分鐘，取ImL菌液，離心，收取細菌保留以備進一步分析；在菌液中加入IPTG，至濃度達到10 μ Μ，隨后，菌液在25°C，200rpm下震蕩培養過夜，在收取全部菌液前，取I毫升菌液，離心，收取細菌，裂解，檢測表達情況；收取全部菌液，15°C條件下，18000g離心10分鐘，收取沉淀(細菌總量為5克)，將全部菌體重懸于15mL裂解緩沖液中(50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，PH值8. 0)，保存于_80°C，以備進一步純化蛋白。采用SDS-PAGE分離細菌裂解液的方法評估蛋白表達情況，取ImL含有細菌的培養基，離心，去除上清，重懸于50mMKP緩沖液(磷酸鉀緩沖液)中，-20°C凍存，實驗時，加入2*SDS-PAGE (樣品緩沖液，在90°C加熱4分鐘，每一孔樣品最終OD值為O. 2 ;3. His-TMV-CP 蛋白的純化來源于500mL培養基中的全部重懸細菌產物在常溫下解凍，隨后立即加入I. 5mLBug Buster試劑，30 μ L Lysonase，苯甲基磺酰氟(PMSF)終濃度為 ImM，5 μ L RNA酶，和5 μ LDNA酶，混合物在30°C，200rpm下震蕩25分鐘，加入30mL預冷的平衡緩沖液，充分混合，置冰上冰浴5分鐘，以llOOOg，4°C離心15分鐘，取上清，與3mL已經平衡緩沖液沖洗的鎳樹脂充分混合，4°C轉動孵育過夜，隨后上蛋白純化柱進行純化；上柱純化蛋白時，首先使液體自然流出蛋白純化柱，直至無液體流出，在隨后的純化階段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脫柱子，首先以50mL預冷緩沖液沖洗柱子，再以沖洗緩沖液-40沖洗柱子，最后，使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白，保存于-20 V。實施例2一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，其殼蛋白模板結構修飾方法的具體步驟如下I. His-TMV-CP表達質粒的構建
兩條引物被用來擴增TMV外殼蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP F1,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC,反應條件如下解鏈溫度 95°C，30 秒，退火溫度 55°C，30秒，延伸溫度68°C，30秒，重復35個循環；PCR產物隨后經NdeI和NcoI雙酶切，使用T4DNA連接酶連接進入pET28a載體，將連接產物電轉化進入XLlBlue菌株，涂于含有100 μ g/mL氨芐的LB瓊脂平板上，37°C倒置孵育過夜，隨后，挑取3個潛在的陽性克隆進行擴增，提取質粒DNA，并送測序，在其羧基端含有His標簽的有確定DNA序列的His-TMV-CP質粒隨后被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達。2. Hi s-TMV-CP 蛋白的表達含有宿主質粒的Rosetta原核表達菌株在含有100 μ g/mL氨節抗生素和25 μ g/mL氯霉素的LB培養基中，在30°C，250rpm條件下持續震蕩搖菌；具體步驟如下從LB瓊脂平板上挑取單個克隆，接種于5mL培養基中，持續搖菌17小時至達到要求密度(從凍存的甘油保種菌液中挑菌，劃線于LB瓊脂平板，30°C倒置培養24小時)取ImL上述菌液培養基，接種·于25mL培養基中，隨后在30°C條件下持續震蕩培養，至OD值達到O. 6，隨后，上述菌液全部接種于500mL培養基中，30°C條件下持續震蕩培養至OD值達到O. 6，在誘導表達前，菌液在25°C條件下孵育5分鐘，取ImL菌液，離心，收取細菌保留以備進一步分析；在菌液中加入IPTG，至濃度達到10 μ Μ，隨后，菌液在25°C，300rpm下震蕩培養過夜，在收取全部菌液前，取I毫升菌液，離心，收取細菌，裂解，檢測表達情況。收取全部菌液，15°C條件下，15000g離心15分鐘，收取沉淀(細菌總量為5克)，將全部菌體重懸于15mL裂解緩沖液中(50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，PH值8. 0)，保存于_80°C，以備進一步純化蛋白；采用SDS-PAGE分離細菌裂解液的方法評估蛋白表達情況，取ImL含有細菌的培養基，離心，去除上清，重懸于50mMKP緩沖液中，_20°C凍存，實驗時，加入2*SDS-PAGE (兩倍的SDS-PAGE)樣品緩沖液，在90°C加熱5分鐘，每一孔樣品最終OD值為O. 2。3. His-TMV-CP 蛋白的純化來源于500mL培養基中的全部重懸細菌產物在常溫下解凍，隨后立即加入I. 5mLBug Buster 試劑，30 μ L Lysonase, PMSF 終濃度為 ImM，5 μ L RNA 酶，和 5 μ L DNA 酶，混合物在30°C，250rpm下震蕩20分鐘，加入30mL預冷的平衡緩沖液，充分混合，置冰上冰浴5分鐘，以llOOOg，4°C離心18分鐘，取上清，與3mL已經平衡緩沖液沖洗的鎳樹脂充分混合，4°C轉動孵育過夜，隨后上蛋白純化柱進行純化；上柱純化蛋白時，首先使液體自然流出蛋白純化柱，直至無液體流出，在隨后的純化階段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脫柱子，首先以50mL預冷緩沖液沖洗柱子，再以沖洗緩沖液-40沖洗柱子，最后，使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白，保存于_20 C。實施例3—種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，其殼蛋白模板結構修飾方法的具體步驟如下I. His-TMV-CP表達質粒的構建兩條引物被用來擴增TMV外殼蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP F1,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC,反應條件如下解鏈溫度 95°C，30 秒，退火溫度 55°C，30秒，延伸溫度68°C，30秒，重復35個循環；PCR產物隨后經NdeI和NcoI雙酶切，使用T4DNA連接酶連接進入pET28a載體，將連接產物電轉化進入XLlBlue菌株，涂于含有100 μ g/mL氨芐的LB瓊脂平板上，37°C倒置孵育過夜，隨后，挑取3個潛在的陽性克隆進行擴增，提取質粒DNA，并送測序，在其羧基端含有His標簽的有確定DNA序列的His-TMV-CP質粒隨后被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達；2. Hi s-TMV-CP 蛋白的表達含有宿主質粒的Rosetta原核表達菌株在含有100 μ g/mL氨節抗生素和 25 μ g/mL氯霉素的LB培養基中，在30°C，300rpm條件下持續震蕩搖菌；具體步驟如下從LB瓊脂平板上挑取單個克隆，接種于5mL培養基中，持續搖菌18小時至達到要求密度(從凍存的甘油保種菌液中挑菌，劃線于LB瓊脂平板，30°C倒置培養24小時)取ImL上述菌液培養基，接種于25mL培養基中，隨后在30°C條件下持續震蕩培養，至OD值達到O. 5，隨后，上述菌液全部接種于500mL培養基中，30°C條件下持續震蕩培養至OD值達到O. 6，在誘導表達前，菌液在25°C條件下孵育6分鐘，取ImL菌液，離心，收取細菌保留以備進一步分析；在菌液中加入IPTG，至濃度達到10 μ Μ，隨后，菌液在25°C，300rpm下震蕩培養過夜，在收取全部菌液前，取I毫升菌液，離心，收取細菌，裂解，檢測表達情況；收取全部菌液，15°C條件下，16000g離心12分鐘，收取沉淀(細菌總量為5克)，將全部菌體重懸于15mL裂解緩沖液中(50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，PH值8. 0)，保存于_80°C，以備進一步純化蛋白。采用SDS-PAGE分離細菌裂解液的方法評估蛋白表達情況，取ImL含有細菌的培養基，離心，去除上清，重懸于50mMKP緩沖液中，_20°C凍存，實驗時，加入2*SDS-PAGE樣品緩沖液，在90°C加熱6分鐘，每一孔樣品最終OD值為0.2。3. His-TMV-CP 蛋白的純化來源于500mL培養基中的全部重懸細菌產物在常溫下解凍，隨后立即加入I. 5mLBug Buster 試劑，30 μ L Lysonase, PMSF 終濃度為 ImM，5 μ L RNA 酶，和 5 μ L DNA 酶，混合物在30°C，300rpm下震蕩40分鐘，加入30mL預冷的平衡緩沖液，充分混合，置冰上冰浴6分鐘，以12000g，4°C離心17分鐘，取上清，與3mL已經平衡緩沖液沖洗的鎳樹脂充分混合，4°C轉動孵育過夜，隨后上蛋白純化柱進行純化；上柱純化蛋白時，首先使液體自然流出蛋白純化柱，直至無液體流出，在隨后的純化階段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脫柱子，首先以50mL預冷緩沖液沖洗柱子，再以沖洗緩沖液-40沖洗柱子，最后，使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白，保存于_20 C。實施例4一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，其殼蛋白模板結構修飾方法的具體步驟如下I. His-TMV-CP表達質粒的構建兩條引物被用來擴增TMV外殼蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP Fl, GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 Hi s-TMV-CP Rl，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC,反應條件如下解鏈溫度 95°C，30 秒，退火溫度 55°C，30秒，延伸溫度68°C，30秒，重復35個循環；CR產物隨后經NdeI和NcoI雙酶切，使用T4DNA連接酶連接進入pET28a載體，將連接產物電轉化進入XLlBlue菌株，涂于含有100 μ g/mL氨芐的LB瓊脂平板上，37°C倒置孵育過夜，隨后，挑取3個潛在的陽性克隆進行擴增，提取質粒DNA，并送測序，在其羧基端含有His標簽的含有確定DNA序列的His-TMV_CP-2質粒隨后被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達。2. Hi s-TMV-CP 蛋白的表達含有宿主質粒的Rosetta原核表達菌株在含有100 μ g/mL氨節抗生素和25 μ g/mL氯霉素的LB培養基中，在30°C，250rpm條件下持續震蕩搖菌；具體步驟如下從LB瓊脂平板上挑取單個克隆，接種于5mL培養基中，持續搖菌16小時至達到要求密度(從凍存的甘油保種菌液中挑菌，劃線于LB瓊脂平板，30°C倒置培養24小時)取ImL上述菌液培養基，接種于25mL培養基中，隨后在30°C條件下持續震蕩培養，至OD值達到O. 5，隨后，上述菌液全部接種于500mL培養基中，30°C條件下持續震蕩培養至OD值達到O. 6，在誘導表達前，菌液在25°C條件下孵育5分鐘，取ImL菌液，離心，收取細菌保留以備進一步分析。在菌液中加入IPTG，至濃度達到10 μ Μ，隨后，菌液在25°C，250rpm下震蕩培養過夜，在收取全部菌液前，取I毫升菌液，離心，收取細菌，裂解，檢測表達情況；收取全部菌液，15°C條件下，17000g離心14分鐘，收取沉淀(細菌總量為5克)，將全部菌體重懸于15mL裂解緩沖液中(50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，PH值8. 0)，保存于_80°C，以備進一步純化蛋白；采用SDS-PAGE分離細菌 裂解液的方法評估蛋白表達情況，取ImL含有細菌的培養基，離心，去除上清，重懸于50mMKP緩沖液中，_20°C凍存，實驗時，加入2*SDS-PAGE樣品緩沖液，煮樣5分鐘，每一孔樣品最終OD值為O. 2。3. His-TMV-CP 蛋白的純化來源于500mL培養基中的全部重懸細菌產物在常溫下解凍，隨后立即加入I. 5mLBugBuster 試劑，30 μ L Lysonase 試劑，PMSF 終濃度為 ImM，5uL RNA 酶，和 5 μ L DNA 酶，混合物在30°C，250rpm下震蕩30分鐘，加入30mL預冷的平衡緩沖液，充分混合，置冰上冰浴5分鐘，以13000g，4°C離心20分鐘，取上清，與3mL已經平衡緩沖液沖洗的鎳樹脂充分混合，4°C轉動孵育過夜，隨后上蛋白純化柱進行純化；上柱純化蛋白時，首先使液體自然流出蛋白純化柱，直至無液體流出，在隨后的純化階段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脫柱子，首先以50mL預冷緩沖液沖洗柱子隨后，再以沖洗緩沖液-40沖洗柱子，最后，使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白，保存于-20 V。
權利要求
1.一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，其特征在于主要通過對HiS-TMV-CP表達質粒的構建、蛋白的表達及純化的方法進行結構的修飾。
2.根據權利要求I所述的煙草花葉病毒模板結構修飾方法，其特征在于所述的殼蛋白模板結構修飾方法的具體步驟如下 DHis-TMV-CP表達質粒的構建 設計上游弓I物TMVCP FI，和下游引物Hi s-TMV-CP Rl，兩條引物被用來PCR擴增TMV外殼蛋白，PCR產物隨后經NdeI和NcoI雙酶切，使用T4DNA連接酶連接進入pET28a載體，將連接產物電轉化進入XLlBlue菌株，涂于LB瓊脂平板上；然后挑取潛在的陽性克隆進行擴增，提取質粒DNA，并送測序，在其羧基端含有His標簽的有確定DNA序列的His-TMV-CP質粒，隨后被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達； 2) Hi s-TMV-CP蛋白的表達 將含有宿主質粒的Rosetta原核表達菌株,置于含有100ug/mL氨節抗生素和25ug/mL氯霉素的LB培養基中，持續震蕩搖菌直至OD值達到O. 5-0. 6，在誘導表達前，菌液在25°C條件下孵育4-6分鐘，取ImL菌液，離心，收取細菌保留以備進一步分析；然后加入誘導劑IPTG至濃度達到10 μ Μ,而后以SDS-PAGE分離細菌裂解液的方法評估蛋白表達情況，待蛋白表達達到最大值，收取全部菌液，將其重懸于裂解緩沖液中，低溫保存，以備進一步純化蛋白； 3) Hi s-TMV-CP蛋白的純化 將重懸細菌產物在常溫下解凍后，立即加入I. 5ml Buster試劑、30ul Lysonase試劑、5ml RNA酶和5ml DNA酶，在ImM的苯甲基磺酰氟濃度下將上述混合物在30°C，250rpm下震蕩20-40分鐘，加入30mL預冷的平衡緩沖液，冰浴4_6分鐘，以11000_13000g，4°C離心15-20分鐘，取上清與3mL已經平衡緩沖液沖洗的鎳樹脂充分混合，4°C轉動孵育過夜，隨后上蛋白純化柱進行純化；上柱純化時，首先使液體自然流出蛋白純化柱，直至無液體流出，在隨后的純化階段，按照恒定的O. 5mL/L的流速洗脫柱子，然后分別以預冷緩沖液、沖洗緩沖液沖洗柱子，最后使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白，保存于_20°C。
3.根據權利要求I或2的修飾方法，其特征在于所述的步驟I)中兩條引物分別是上游引物 TMVCP Fl, GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 His-TMV-CP Rl,TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTCo
4.根據權利要求I或2的修飾方法，其特征在于所述的步驟I)中PCR產物擴增的反應條件是解鏈溫度95°C，30秒，退火溫度55°C，30秒，延伸溫度68°C，30秒，重復35個循環。
5.根據權利要求I或2的修飾方法，其特征在于所述的步驟3)中預冷緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，ImM PMSF, IOmM β -巰基乙醇，IOmM咪唑，10%乙醇，PH值8. O ;沖洗緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，ImM PMSF, IOmM β -巰基乙醇，40mM咪唑，10%乙醇，PH值8.O ;洗脫緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，ImM PMSF，IOmM β -巰基乙醇，500mM咪唑，10% 乙醇，PH 值 8. O。
全文摘要
本發明涉及了一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，其主要通過對His-TMV-CP表達質粒的構建、蛋白的表達及純化的方法進行結構的修飾。煙草花葉病毒是一種典型的具有一維納米結構的模板材料，本發明用分子生物學的方法，將His標簽引入到TMV-CP中，His標簽之間以及His標簽與TMV-CP之間的強相互作用，改善TMV-CP的結構均一性，使得TMV-CP在介質較大的pH值、溫度以及離子強度范圍內，保持結構的穩定以及連續性，進而改善TMV-CP作為模板材料的適用性。
文檔編號C12N15/70GK102899346SQ20121033622
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者劉楠, 張洪非, 侯宏衛, 李中皓, 唐綱嶺, 陳再根, 姜興益, 李雪, 陳歡, 胡清源 申請人:國家煙草質量監督檢驗中心