一種自體外周血淋巴細胞的培養方法

專利名稱：一種自體外周血淋巴細胞的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種自體外周血淋巴細胞(Autologous immunotherapylymphocytes, AIL)的培養方法,屬于免疫細胞體外培養技術領域。
背景技術：
過繼性免疫療法是將致敏淋巴細胞(具有特異免疫力)或其產物輸給細胞免疫功能低下者(如腫瘤病人)，使其獲得抗腫瘤免疫力，它是用來治療腫瘤的一種免疫療法。基于腫瘤的發生、發展和預后與機體免疫功能，尤其是細胞免疫功能關系密切，1985年美國國家癌癥研究委員會將癌癥的免疫療法確立為繼外科手術、放射療法和化學藥物療法之后的第四種療法。AIL細胞即屬于過繼免疫療法中的一員。與傳統方法相比，AIL細胞因具有以下四個方面的優勢而廣泛應用于臨床
I、減少惡性腫瘤術后復發與轉移。手術后進行免疫治療，可顯著增強腫瘤患者免疫系統功能，有利于清除術后體內殘留的癌細胞及微轉移灶，降低局部復發和向遠處轉移的概率。2、參與腫瘤綜合治療。腫瘤是一個由遺傳因素及環境因素綜合作用引起的多基因突變疾病。因此它的治療方案也是幾種治療方式的綜合。在腫瘤放療和化療間歇期間進行免疫細胞治療，有助于增強患者自身的免疫力，從而增加對放療和化療毒副反應的耐受能力，提聞癌癥綜合治療的療效。3、少數腫瘤的主要治療手段。免疫細胞治療是肝癌、腎癌、惡性黑色素瘤等一些對放化療敏感性較低的惡性腫瘤的有效治療手段。4、改善晚期癌癥患者的生活質量。由于免疫細胞治療的副作用極低，可以減輕晚期患者的痛苦，提高他們的生活質量。AIL技術較之其他過繼免疫治療方法，如LAK、TIL等技術，在安全性和有效性上作了近一步的提聞和優化，具有如下特點I、AIL細胞是以殺傷性T淋巴細胞為主的混合性T淋巴細胞和NK細胞群體；其中⑶3+CD56+T淋巴細胞和⑶8+T淋巴細胞是主要的效應細胞。II、采用無血清培養體系AIL細胞體外培養體系采用獨特的無血清培養基和細胞因子組合。無血清培養系統避免了因使用血清可能導致的細胞污染及其它對細胞生長的不利因素；所采用的細胞因子均為藥用級別。III、細胞擴增效率高，不需要使用單核細胞采集機在體外高效活化和擴增患者自身的T淋巴細胞，從1-2 X IO7外周血單個核細胞開始，可以獲得1-2 X 101°活化擴增的以殺傷性T淋巴細胞為主的T細胞和NK細胞混合細胞群體，這種高效擴增，避免了需要使用大量起始外周血單個核細胞對患者整體免疫細胞系統的破壞作用。IV、細胞活性高、穩定性好:AIL細胞培養體系培養出的細胞，活性和穩定性好，細胞可保存12個小時而不影響其治療效果(細胞活性>95%)。特別是AIL可以凍存細胞，精準的培養系統緊密配合手術、放療和化療。
現有的自體淋巴細胞培養技術擴增效率較低，細胞殺瘤活性弱，批間穩定性較差，往往需要采集較多的外周血，甚至需要用單采機直接采集患者單個核細胞，對患者身體影響較大，有的患者在采集后會出現渾噩的現象
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種培養自體外周血淋巴細胞的方法。術語說明PBMC :外周血單個核細胞；IL-2:白細胞介素2;PHA-p :植物凝集素P ;IL-Ia :白細胞介素I a ；IFN- Y :干擾素 Y ；⑶3mAb :細胞表面分子3單克隆抗體；⑶28mAb :細胞表面分子28單克隆抗體。本發明的技術方案如下一種培養自體外周血淋巴細胞的方法，包括如下步驟(I)從外周血中分離PBMC，然后，重懸于無血清培養基中，使PBMC的細胞濃度為(I 2) X IO6個/mL，靜置培養72 84小時，制得初培養液；(2)向步驟(I)制得的初培養液中補加無血清培養基至初培養液的2 3倍，同時添加IL-2，使IL-2的濃度為I X 103U/mL,靜置培養84 96小時，得二次培養液；(3)向步驟(2)制得的二次培養液中補加無血清培養基至二次培養液的4 5倍，同時添加IL-2，使IL-2的濃度為(I 2) X 103U/mL,靜置培養72 84小時，得培養液；(4)將步驟(3)制得的培養液均勻分成2份，然后用無血清培養基補足體積并添加IL-2，使IL-2的濃度為(I 2) X 103U/mL,靜置培養72 84小時，重復本步驟2 3次，制得自體外周血淋巴細胞；所述步驟(I)中的無血清培養基，每毫升含有如下組分IFN- Y 500 2500U、PHA_p 250 1500ng、IL-I a 50 250U、CD3mAb 25 150ng、CD28mAb 25 150ngo根據本發明優選的，所述步驟(I)中的無血清培養基，每毫升含有如下組分IFN- Y 1000 2000U、PHA-p 500 lOOOng、IL-I a 100 200U、CD3mAb 50 lOOng、CD28mAb 50 100ng。根據本發明進一步優選的，所述步驟(I)中的無血清培養基，每毫升含有如下組分IFN-y2000U、PHA-p 1000ng、IL-I a 200U、CD3mAb 100ng、CD28mAb IOOngo所述步驟(I) (4)中的靜置培養條件為在溫度為37°C、CO2體積百分比為含量為5 7. 5%、相對飽和濕度為100%的CO2培養箱中培養。所述步驟(4)還包括將制得的自體外周血淋巴細胞經離心后，重懸于保存液中，所述保存液每百毫升含有如下組分體積百分比為20%的人血清白蛋白I 7mL,0. 9wt%氯化鈉溶液定容至100mL。
根據本發明優選的，所述保存液含有如下組分體積百分比為20%的人血清白蛋白5mL, O. 9wt%氯化鈉溶液定容至100mL。在AIL的培養體系中，AIL細胞是通過誘導活化的T細胞分化而來，⑶3分子能夠轉導T細胞抗原受體識別抗原所產生的活化信號，因此加入CD3mAb可提高T細胞活化效率；CD28分子表達與T細胞表面，它提供共刺激分子信號，這是T細胞活化必不可少的一部分，因此加入CD28mAb可以提高T細胞活化效率；而IFN-γ是由活化T細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)產生的具有抗病毒、免疫調節及抗腫瘤特性的一類細胞因子。可以與結合到干擾素Y受體(IFNGR)，激活抗原提呈細胞從而促進I型輔助T細胞(Thl細胞)的分化；PHA-p可以促進細胞的有絲分裂，從而提高AIL細胞的擴增效率。IL-Ia可促進細胞分泌IL_2，共刺激⑶8+/IL-1 α +細胞并且可以殺傷部分腫瘤細胞。本發明的有益效果如下
I、本發明通過向無血清培養基中添加多種單抗及細胞因子，提高效應細胞群活化 效率和擴增效率。經檢測，活化及擴增效率較現有方法明顯提高，激活3天左右有大量細胞團出現。2、本發明采用無血清培養基，減少因添加血清帶來的不穩定因素，保持AIL細胞批次間質量的穩定性。3、本發明通過保護液來保存制得的AIL細胞，該保護液可以使制備的AIL細胞經長途運輸后，仍然保持較高的活性和穩定性。


圖I、實施例I的自體外周血淋巴細胞擴增曲線圖；圖2、實施例2的自體外周血淋巴細胞擴增曲線圖；圖3、實施例3的自體外周血淋巴細胞擴增曲線圖；圖4、對比例的自體外周血淋巴細胞擴增曲線圖；圖5、實施例I的自體外周血淋巴細胞細胞毒性實驗實驗結果柱狀圖；圖6、實施例2的自體外周血淋巴細胞細胞毒性實驗實驗結果柱狀圖；圖7、實施例3的自體外周血淋巴細胞細胞毒性實驗實驗結果柱狀圖；圖8、對比例的自體外周血淋巴細胞細胞毒性實驗結果柱狀圖；圖9、實施例I培養14天后的自體外周血淋巴細胞表面⑶3\OT8標記；圖10、實施例2培養14天后的自體外周血淋巴細胞表面⑶3\OT8標記；圖11、實施例3培養14天后的自體外周血淋巴細胞表面⑶3\OT8標記；圖12、對比例培養14天后的自體外周血淋巴細胞表面⑶3\OT8標記；圖13、實施例I培養14天后的自體外周血淋巴細胞表面⑶3\OT56標記；圖14、實施例2培養14天后的自體外周血淋巴細胞表面⑶3\OT56標記；圖15、實施例3培養14天后的自體外周血淋巴細胞表面⑶3\OT56標記；圖16、對比例培養14天后的自體外周血淋巴細胞表面⑶3\OT56標記；圖17、細胞保存液組分與細胞活性關系。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護范圍不限于此。原料說明PBMC,采自腫瘤患者外周血，經分離后得到。IL-2，購自山東泉港藥業有限公司。PHA-p,購自 Sigma 公司。IL-I α ,購自 R&D Systems 公司，10 μ g/ 支。CD3mAb,購自 R&D Systems 公司。 CD28mAb,購自 R&D Systems 公司。IFN- Y，購自上海凱茂生物醫藥有限公司，106U/mL。本實施例的目的是通過與現有技術實施方案的對比，使本領域技術人員充分了解本發明的技術方案及相應的技術效果，至于本實施例所用到的各種試劑均在市場上能夠買至IJ，不同廠家生產的試劑按照本領域常規處理后，不會造成本實施例實驗結果的不同。實施例I一種培養自體外周血淋巴細胞的方法，包括如下步驟(I)從50 IOOmL外周血中分離PBMC后，重懸于50mL無血清培養基中，PBMC的細胞濃度為2X IO6個/mL，置于37°C、體積百分比為7. 5%C02、相對飽和濕度為100%的CO2
培養箱中靜置培養72小時，制得初培養液；(2)向步驟(I)制得的初培養液中補加無血清培養基至200mL，同時添加IL_2，使IL-2的濃度為lX103U/mL，置于37°C、體積百分比為7. 5%C02、相對飽和濕度為100%的CO2培養箱中靜置培養96小時,得二次培養液；(3)將步驟(2)制得的二次培養液轉移至I. 8L細胞培養袋中，補加無血清培養基至IOOOmL,同時添加IL-2，使IL-2的濃度為I X 103U/mL,置于37°C、體積百分比為7. 5%C02、相對飽和濕度為100%的CO2培養箱中靜置培養72小時，得培養液；(4)將步驟(3)制得的培養液均勻分成2份，然后用無血清培養基補足體積并添加IL-2，使IL-2的濃度為lX103U/mL，置于37°C、體積百分比為7. 5%C02、相對飽和濕度為100%的CO2培養箱中靜置培養72小時，重復本步驟連續培養28天，分批收獲AIL細胞，制得自體外周血淋巴細胞；所述無血清培養基每毫升含有如下組分IFN-y 1000U、PHA-p 500ng、IL-I a 100U、CD3mAb 50ng、CD28mAb 50ng。實驗結果分別在第1、6、9、12、14、16、19、21天收集本實施例制得的自體外周血淋巴細胞用于以下各項測試。I、細胞增殖倍數的測定將取得的細胞用臺盼藍染色后再用血球計數板進行計數，并記錄計數結果，以培養天數為橫坐標，以擴增倍數為縱坐標(擴增倍數=將當前活細胞總數+第I天起始培養的單個核細胞數)作圖，結果如圖I所示。結果顯示，培養在I 21天時，AIL細胞的擴增倍數隨時間的推移而逐漸上升，I 5天時基本呈直線持平趨勢，擴增效率保持恒定，6 21天由于細胞基數較大和傳代的原因使擴增倍數緩慢上升，在培養到第21天時達到最大值。2、細胞毒性實驗取培養至第14天的AIL細胞，與宮頸癌細胞株(又名Hela細胞，購自中國科學院上海細胞研究所)按40:1、20:1和10:1的比例鋪于96孔板中在37°C、體積百分比為7. 5%C02的條件下進行共培養，培養24h后每孔加入CCK-8試劑10 μ L進行染色，在培養箱中(37°C、體積百分比為7. 5%C02)孵育2h后在450nm的波長下檢測每個孔的OD值，按如下公式計算AIL細胞的殺傷率，結果如圖5所示。細胞存活率(％ )=(實驗組A45tl平均值-調零組A45tl平均值)/ (對照組A45tl平均值-調零組A45tl平均值)X 100%·殺瘤活性(％) =1-細胞存活率結果顯示，培養至第14天的AIL細胞對Hela細胞的高殺傷力均高于50%(效靶比為10:1的AIL細胞殺傷率為51. 05%)。且效靶比越高，AIL細胞的殺瘤活性越強，效靶比為40:1 時達到 75. 06%ο3、細胞表面標記分析取培養14天的AIL細胞6 X IO6,洗滌后用生理鹽水制成懸液，平均分成6份，每份lmL。分別加入 CD3mAb、CD56mAb、CD8mAb、CD3mAb+CD8mAb、CD3mAb+CD56mAb 以及等體積的生理鹽水，避光孵育30min后，洗滌去除多余抗體，進行流式細胞檢測，結果如圖9、13所示。
結果顯示，培養14天的AIL細胞其表面的⑶3+CD56+細胞的比率為10. 65%、CD3+CD8.的 70. 91%, CD3+CD56.和 CD3+CD8.是 AIL 的主要效應細胞群。CD3+CD56+ 細胞和CD3+CD8+的含量越高，細胞殺瘤活性越強。實施例2如實施例I所述的方法，不同之處在于，無血清培養基每毫升含有如下組分IFN-y 1500U、PHA-p 750ng、IL-I a 150U、CD3mAb 75ng、CD28mAb 75ng。實驗結果檢測過程如實施例I所述。經檢測，I、細胞增殖倍數的測定結果顯示，培養在I 21天時，AIL細胞的擴增倍數隨時間的推移而逐漸上升，I 5天時基本呈直線持平趨勢，擴增效率保持恒定，6 18天由于細胞基數較大和傳代的原因使擴增倍數基本呈直線上升，18 21天擴增效率增加，在培養到第21天時達到最大值，與實施例I相比，最大擴增倍數提高I倍，結果如圖2所示。2、細胞毒性實驗結果顯示，培養至第14天的AIL細胞對Hela細胞的高殺傷力均高于59%(效靶比為10:1的AIL細胞殺傷率為59. 13%)。且效靶比越高，AIL細胞的殺瘤活性越強，效靶比為40:1時達到84. 01%，與實施例I相比，平均殺傷率提高10%左右，結果如圖6所示。3、細胞表面標記分析結果顯示，培養14天的AIL細胞其表面的⑶3+CD56+細胞的比率為34. 91%、⑶3+CD8+的56. 94%，⑶3+⑶56+和⑶3+⑶8+是AIL的主要效應細胞群。與實施例I相比，按實施例2培養得到的AIL細胞其CD3+CD56+細胞的含量有大幅度提高，結果如圖10、14所
/Jn ο
實施例3如實施例I所述的方法，不同之處在于，無血清培養基每毫升含有如下組分IFN- Y2000U、PHA-p lOOOng、IL-I a 200U、CD3mAb lOOng、CD28mAb IOOngo實驗結果檢測過程如實施例I所述。經檢測，I、細胞增殖倍數的測定 結果顯示，培養在I 21天時，AIL的擴增倍數隨時間的推移而逐漸上升，I 5天時基本呈直線持平趨勢，擴增效率保持恒定，6 15天由于細胞基數較大和傳代的原因使擴增倍數基本呈直線上升，18 21天擴增效率增加呈直線上升，在培養到第21天時達到最大值，與實施例2相比，最大擴增倍數約提高1/3，結果如圖3所示。2、細胞毒性實驗結果顯示，培養至第14天的AIL細胞對Hela細胞具有較高殺傷力，均高于67%(效靶比為10:1的AIL細胞殺傷率為67. 14%)。且效靶比越高，AIL的殺瘤活性越強，效靶比為40:1時達到92. 01%，與實施例2相比，平均殺傷率提高8%左右，結果如圖7所示。3、細胞表面標記分析結果顯示，培養14天的AIL細胞其表面的⑶3+CD56+細胞的比率為70. 11%、CD3+CD8.的 35. 70%, CD3+CD56.和 CD3+CD8.是 AIL 的主要效應細胞群。因 CD3+CD56.是非特異性殺傷腫瘤的效應細胞群，因此其細胞比例的提高對抗腫瘤譜的擴大有十分積極的意義。⑶3+CD56+細胞和⑶3+CD8+的比例越高，細胞殺瘤活性越強，實驗2和3相互印證了通過該法培養的AIL細胞具有較好的癌細胞殺傷效果，結果如圖11、15所示。對比例一種培養淋巴細胞的傳統方法，包括如下步驟(I)從50 IOOmL外周血中分離PBMC后，重懸于含10%FBS的RPMI-1640培養基中，置于37°C、體積百分比為7. 5%C02、相對飽和濕度為100%的CO2培養箱中靜置培養72小時，制得初培養液；(2)向步驟(I)制得的初培養液中補加上述培養基至200mL，同時添加IL-2，使IL-2的濃度為lX103U/mL，置于37°C、體積百分比為7. 5%C02、相對飽和濕度為100%的CO2
培養箱中靜置培養96小時,得二次培養液；(3)將步驟(2)制得的二次培養液轉移至I. 8L細胞培養袋中，補加上述培養基至IOOOmL,同時添加IL-2，使IL-2的濃度為I X 103U/mL，置于37°C、體積百分比為7. 5%C02、相對飽和濕度為100%的CO2培養箱中靜置培養72小時，得培養液；(4)將步驟(3)制得的培養液均勻分成2份，然后用上述培養基補足體積并添加IL-2，使IL-2的濃度為I X 103U/mL,，靜置培養72小時，重復本步驟連續培養28天，分批收獲細胞，制得淋巴細胞；實驗結果檢測過程如實施例I所述。經檢測，I、細胞增殖倍數的測定結果顯示，培養在I 21天時，淋巴細胞的擴增倍數隨時間的推移而緩慢上升，且增殖效率始終低于100，遠遠低于AIL細胞的增殖倍數(最高擴增倍數522)，結果如圖4所/Jn ο2、細胞毒性實驗結果顯示，培養至第14天的淋巴細胞對Hela細胞的殺傷效率較低，最大值仍不足50%。最小值只有21. 43%，遠遠低于AIL細胞的殺傷效率(51. 05% 92. 01%),結果如圖8所
/Jn ο3、細胞表面標記分析結果顯示，培養14天的AIL細胞其表面的⑶3+⑶56+細胞的比率為3. 94%、⑶3+⑶8+的10. 99%，⑶3+⑶56+細胞和⑶3+⑶8+的含量越高，細胞殺瘤活性越強，這也印證了與傳統培養方法相比，AIL細胞具有較好的癌細胞殺傷效果，結果如圖12、16所示。 實施例4配制保存液I 4組，其中保存液I組，含有如下組分體積百分比為20%人血清白蛋白ImL, O. 9wt%氯化鈉溶液定容至100mL。保存液2組，含有如下組分體積百分比為20%人血清白蛋白3mL,0. 9wt%氯化鈉溶液定容至lOOmL。保存液3組，含有如下組分體積百分比為20%人血清白蛋白5mL,0. 9wt%氯化鈉溶液定容至lOOmL。保存液4組，含有如下組分體積百分比為20%人血清白蛋白7mL,0. 9wt%氯化鈉溶液定容至lOOmL。對照組，含有如下組分體積百分比為20%人血清白蛋白OmL, O. 9wt%氯化鈉溶液定容至lOOmL。將實施例3制得的自體外周血淋巴細胞平均分為5份，4份分別重懸于保存液I 4組中，第5份重懸于對照組，經10 15°C保溫箱內放置12小時后，將細胞懸液取出測定細胞的活性。實驗結果將取得的細胞用臺盼藍染色后再用血球計數板進行計數，并記錄計數結果，以組別為橫坐標，以細胞存活率為縱坐標(細胞存活率=將當前活細胞總數+細胞總數X100%)作圖，結果如圖17所示。對照組細胞活性最低，只有65%，I 4組細胞活性依次遞增，其中組3和組4的細胞活性均在90%以上，達到我們細胞的質量標準，且兩組之間差別不大，考慮到以后量產的成本因素，選擇組3為最佳細胞保存液。
權利要求
1.一種培養自體外周血淋巴細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)從外周血中分離外周血單個核細胞，然后，重懸于無血清培養基中，使外周血單個核細胞的細胞濃度為(I 2) X IO6個/mL，靜置培養72 84小時，制得初培養液； (2)向步驟(I)制得的初培養液中補加無血清培養基至初培養液的2 3倍，同時添加白細胞介素2，使白細胞介素2的濃度為lX103U/mL，靜置培養84 96小時，得二次培養液； (3)向步驟(2)制得的二次培養液中補加無血清培養基至二次培養液的4 5倍，同時添加白細胞介素2，使白細胞介素2的濃度為(I 2) X 103U/mL，靜置培養72 84小時，得培養液； (4)將步驟(3)制得的培養液均勻分成2份，然后用無血清培養基補足體積并添加白細胞介素2，使白細胞介素2的濃度為(I 2) X 103U/mL，靜置培養72 84小時，重復本步驟2 3次，制得自體外周血淋巴細胞； 所述步驟(I)中的無血清培養基，每毫升含有如下組分 干擾素Y 500 2500U、植物凝集素P 250 1500ng、白細胞介素I α 50 250U、細胞表面分子3單克隆抗體25 150ng、細胞表面分子28單克隆抗體25 150ng。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的無血清培養基，每毫升含有如下組分 干擾素Y 1000 2000U、植物凝集素P 500 lOOOng、白細胞介素I α 100 200U、細胞表面分子3單克隆抗體50 lOOng、細胞表面分子28單克隆抗體50 100ng。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的無血清培養基，每毫升含有如下組分 干擾素Y2000U、植物凝集素P 1000ng、白細胞介素la 200U、細胞表面分子3單克隆抗體100ng、細胞表面分子28單克隆抗體100ng。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I) (4)中的靜置培養條件為在溫度為37°C、CO2體積百分比為含量為5 7. 5%、相對飽和濕度為100%的CO2培養箱中培養。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)還包括將制得的自體外周血淋巴細胞經離心后，重懸于保存液中，所述保存液含有如下組分 體積百分比為20%的人血清白蛋白I 7mL,0. 9wt%氯化鈉溶液定容至100mL。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述保存液含有如下組分 體積百分比為20%的人血清白蛋白5mL，0. 9wt%氯化鈉溶液定容至100mL。
全文摘要
本發明涉及一種自體外周血淋巴細胞的培養方法，包括如下步驟(1)從外周血中分離PBMC，然后，重懸于無血清培養基中，靜置培養，制得初培養液；(2)向初培養液中補加無血清培養基，同時添加IL-2，靜置培養，得二次培養液；(3)向二次培養液中補加無血清培養基，同時添加IL-2，靜置培養，得培養液；(4)將培養液均勻分成2份，然后用無血清培養基補足體積并添加IL-2，靜置培養，重復本步驟，制得自體外周血淋巴細胞；本發明通過向無血清培養基中添加多種單抗及細胞因子，提高效應細胞群活化效率和擴增效率。經檢測，活化及擴增效率較現有方法明顯提高，激活3天左右有大量細胞團出現。
文檔編號C12N5/0783GK102816735SQ20121033547
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者王芝輝, 梁晨, 孔飛 申請人:山東省齊魯細胞治療工程技術有限公司, 王芝輝, 梁晨, 孔飛