專利名稱：擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶ugt74d1在催化合成生長素糖酯中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用，尤其涉及一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1在催化合成生長素糖酯中的應(yīng)用；屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生長素是植物的重要激素之一，它對植物的生長發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)控制作用。天然存在的生長素如吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)以及人工合成的生長素類物質(zhì)如2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)等都被廣泛應(yīng)用在科研和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。這些生長素類物質(zhì)都含有一個羧基基團(-C00H)。在植物體內(nèi)，該羧基上的羥基可與葡萄糖以共價鍵結(jié)合，從而形成生長素的糖酯。生長素的糖酯被認為是生長素的失活形式和貯藏形式(Bartel, 1997)。當(dāng)前，生長素的糖酯常作為標準品被用在生長素糖基化修飾等科學(xué)研究中。在化學(xué)和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，獲得生長素糖酯的途徑主要有兩種從植物中提取和化學(xué)合·成。由于在植物中生長素糖酯的天然含量很低，提取量非常有限，純度難以保證，并且提取過程復(fù)雜。如果用化學(xué)方法合成，也有過程復(fù)雜、成本高、環(huán)境污染等缺點。相比之下，生物酶法合成生長素糖酯化合物則具有效率高、成本低、環(huán)境清潔等優(yōu)點。植物體內(nèi)有一類酶，被稱為糖基轉(zhuǎn)移酶，它們專門負責(zé)植物體眾多化合物的糖基化修飾，即催化某些化合物形成相應(yīng)的糖酯(或糖苷)。糖基化是一種普遍的生理現(xiàn)象，是植物細胞維持代謝平衡的主要機制之一，在維持植物正常生長發(fā)育、應(yīng)對環(huán)境壓力等方面具有重要的作用(Lim et al，2004;王軍等，2009)。到目前為止，生物界存在的糖基轉(zhuǎn)移酶按照催化的底物性質(zhì)和序列相關(guān)性可以分為94個家族。其中家族I (GTl)的酶所催化的底物是一些親脂性的小分子化合物，在其-0H、-C00H、-NH2、-SH或C-C基團上能催化結(jié)合上一個或多個糖基(Bowles et al. 2005)。針對生長素糖酯化合物的合成，目前已經(jīng)從擬南芥發(fā)現(xiàn)了一個糖基轉(zhuǎn)移酶，即UGT84B1 (Jackson et al. 2001 )，該酶對IAA具有最大的酶催化活性。然而，經(jīng)過檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)其他的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶在催化合成生長素糖酯中的作用，特別是擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1在催化合成生長素糖酯中的應(yīng)用的報道。
發(fā)明內(nèi)容
(I)本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1在催化合成生長素糖酯中的應(yīng)用。(2)實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案本發(fā)明所述的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1在催化合成生長素糖酯中的應(yīng)用。其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。該糖基轉(zhuǎn)移酶是通過糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT74D1在大腸桿菌中表達和純化后獲得的。糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT74D1是通過RT-PCR方法從擬南芥中克隆的。所述生長素是指吲哚甲酸(ICA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丙酸(IPA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。本發(fā)明提供新的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1能夠催化多種生長素物質(zhì)形成糖酯。將糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1與生長素之一放于反應(yīng)管中，按實施例2中所指出的條件進行酶促反應(yīng)，即可催化合成相應(yīng)的生長素糖酯。與已經(jīng)報道的UGT84B1不同的是，本發(fā)明所述糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1對IBA具有最大催化活性。(3)本發(fā)明實施后可能帶來的有益效果本發(fā)明是在國內(nèi)外首次證明擬南芥的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1可以催化多種生長素化合物生成其糖酯物質(zhì)。本發(fā)明的公開為體外利用酶催化方法合成這些生長素物質(zhì)的糖酯 物提供了可行的方法。用提取方法或化學(xué)合成方法獲得生長素糖酯物不僅效率低，而且缺乏專一性。而用糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1催化方法則可以高效、專一性的合成吲哚丁酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、萘乙酸等相對應(yīng)的的糖酯(見附圖I至附圖6)。本發(fā)明實施后將為生長素糖酯合成工業(yè)帶來巨大經(jīng)濟效益。
圖I.純化的融合蛋白GST-UGT74D1用SDS-PAGE檢測。其中，M為蛋白質(zhì)分子量標記；序號I泳道為GST標簽蛋白，作為對照；序號2泳道為純化的GST-UGT74D1融合蛋白，其中有微弱的GST帶，是一種在pGEX純化系統(tǒng)中比較常見的現(xiàn)象。圖2.純化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚丁酸形成糖酯，催化產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析。其中I為對照組，純化的GST標簽蛋白與吲哚丁酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-UGT74D1融合蛋白與吲哚丁酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的產(chǎn)物峰(箭頭b所指)，該產(chǎn)物被推測為吲哚丁酸糖酯。圖中的a為底物吲哚丁酸。圖3.吲哚丁酸的催化產(chǎn)物用質(zhì)譜(LC-MS)鑒定。其中上圖表示吲哚丁酸糖酯的標準質(zhì)譜圖，下圖表示吲哚丁酸的催化產(chǎn)物(圖2中的peakb)的質(zhì)譜圖。兩圖特征峰相同，證明吲哚丁酸在酶的催化下形成了糖酯。圖4.純化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚丙酸形成糖酯，催化產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析。其中I為對照組，純化的GST標簽蛋白與吲哚丙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-UGT74D1融合蛋白與吲哚丙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的產(chǎn)物峰(箭頭c所指)，該產(chǎn)物即為吲哚丙酸糖酯。圖5.純化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚乙酸形成糖酯，催化產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析。其中I為對照組，純化的GST標簽蛋白與吲哚乙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-UGT74D1融合蛋白與吲哚乙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的產(chǎn)物峰(箭頭d所指)，該產(chǎn)物即為吲哚乙酸糖酯。圖6.純化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化萘乙酸形成糖酯，催化產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析。其中I為對照組，純化的GST標簽蛋白與萘乙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-UGT74D1融合蛋白與萘乙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的產(chǎn)物峰(箭頭e所指)，該產(chǎn)物即為萘乙酸糖酯。
具體實施方式
實施例I擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT74D1的克隆、原核表達與酶蛋白純化I.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT74D1的克隆本發(fā)明涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT74D1是通過RT-PCR擴增技術(shù)從擬南芥中克隆的。首先利用TRIzoI方法從擬南芥幼嫩葉片提取RNA，然后用RT-PCR方法擴增得到該基因的編碼區(qū) cDNA。擴增時用的一對引物是UGT74Dl_a: 5’ -cgccatatgggagagaaagcgaaagc_3，；UGT74Dl_b: 5，-ccgctcgagttacctcacaattttagc-3，。RT-PCR 擴增程序為94 °C (預(yù)變性)，5min ;94°C (變性)，IOs ;55°C (退火)，15s ;72°C (延伸)，2min ;35cycle ;72°C (終延伸)，10min?；厥詹⒓兓瘮U增產(chǎn)物。將擴增獲得的目的基因UGT74D1與EcoRV單酶切的中間載體pBluescript SK連接，獲得載體pB74Dl，對克隆到的基因進行測序。2. UGT74D1的序列信息與特性對克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT74D1測序后發(fā)現(xiàn)，該基因的cDNA編碼區(qū)長度為1371bp，編碼456個氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為51. 1KD，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。其C端有一個含44個氨基酸的PSPG盒，該盒是催化小分子化合物的糖基轉(zhuǎn)移酶共同具有的保守序列，說明克隆的基因是擬南芥的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。3.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT74D1的原核表達載體構(gòu)建在公開通用的原核表達載體PGEX-2T的基礎(chǔ)上，按照《分子克隆》(Sambrook等編著)所示的方法，對該載體進行改造，使其多克隆位點包含NdeI和Xhol。用NdeI和XhoI雙酶切該表達載體，回收載體片段備用。同時用NdeI和XhoI雙酶切前述載體PB74D1，回收得到目的基因片段，并將其連入上述原核表達載體中，得到擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT74D1的原核表達載體PGEX-74D1。4.轉(zhuǎn)化大腸桿菌、誘導(dǎo)蛋白表達及酶蛋白的純化將上述原核表達載體pGEX-74Dl轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XLl_Blue，PCR和酶切驗證正確后，保存菌種，此菌種用于融合蛋白(GST-UGT74D1)的表達純化。在添加了氨芐青霉素(100mg/L)的2XYT液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)上述菌種，以活化該菌種。然后將過夜培養(yǎng)物按照1:100 (過夜培養(yǎng)物新的2XYT液體培養(yǎng)基)的比例擴大至75ml培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl=O. 8。然后加入IPTG至O. 2mM，轉(zhuǎn)到20°C震蕩培養(yǎng)24h以誘導(dǎo)目的蛋白表達。到時間后通過離心收集菌體。菌體加入2ml Blast Buffer (O. 5mM EDTA，750mM 蔗糖，200mM Tris_HCl，pH=8. 0)重懸,立即加入14ml稀釋的(1/2 X )Blast Buffer (事先添加2mg溶菌酶),混勻后于冰上放置30min，離心收集菌體，用PBS(內(nèi)含O. 2mM的PMSF)重懸，冰上放置30min后IOOOOrpm離心20min，取上清。在上清中加入100 μ I的谷胱甘肽瓊脂糖珠子，按照pGEX蛋白純化手冊操作，最后用Elution Buffer (50mM Tris-HCl，IOmM還原型谷胱甘肽，pH=8. O)洗脫目的蛋白。目的蛋白的純度用SDS-PAGE方法檢測，蛋白濃度按照Bradford試劑盒說明書中的方法進行測定(用BSA作為蛋白標準)。實施例2擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1催化生長素糖酯的合成I.生長素的酶催化反應(yīng)
用純化到的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1的融合蛋白(GST-UGT74D1，能夠反映UGT74D1的催化活性，屬于常用的做法)進行體外的酶催化反應(yīng)，選取6種生長素化合物作為底物，包括吲哚甲酸(ICA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丙酸(IPA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。催化反應(yīng)中用UDP-葡萄糖作為糖的供體。酶促反應(yīng)
體系如下
HEPES (pH=7.0)ιπΜ
MgSO42、
mM
KClIOm
M
UDP-葡萄糖i 25
mM
生長素I
mM
糖基轉(zhuǎn)移酶I 2
m
dc! H0up to
200μ1將以上混合好的反應(yīng)體系放于37°C恒溫水浴鍋中，反應(yīng)3小時。然后加入20 μ I濃度為240mg/ml的三氯乙酸終止反應(yīng)。將反應(yīng)管用液氮速凍后存放在_20°C，直到HPLC分析。2.酶催產(chǎn)物的HPLC鑒定用高效液相色譜(HPLC)分析以上的反應(yīng)混合體系，所用的儀器為島津LC-20AT，柱子為C18 (Ultimate, 4. 6 X 150mm, 5 μ m),工作站為Ver I. 21, 二極管陣列檢測器。流動相為甲醇和水(均含有O. 1%的磷酸)，二元高壓梯度洗脫，其中有機相的比例分別為吲哚丁酸、吲哚丙酸、萘乙酸為10%-70%，吲哚乙酸為10%-48%。洗脫時間為22min。上樣量為20 μ I。HPLC分析顯示，與對照(反應(yīng)體系中只含有純化的GST標簽蛋白)相比，UGT74D1融合蛋白對6種生長素化合物都能催化合成相應(yīng)的糖酯(附圖中圖I 圖6只顯示其中4種生長素的HPLC分析結(jié)果)。3.酶催產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定對酶催化產(chǎn)物進行LC-MS鑒定，儀器為Surveyor MSQ,所用的流動相為甲醇和水(均含有O. 1%的磷酸)，有機相梯度和洗脫時間同上述HPLC方法。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物為各自生長素的糖酯產(chǎn)物(作為代表，附圖只出示了吲哚丁酸糖酯的質(zhì)譜結(jié)果，見附圖3)。由此得出結(jié)論擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1可用于催化合成生長素的糖酯。
權(quán)利要求
1.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1在催化合成生長素糖酯中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述生長素是吲哚甲酸(ICA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丙酸(IPA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(應(yīng)么)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1在催化合成生長素糖酯中的應(yīng)用；其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述生長素是吲哚甲酸、吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸，將糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74D1與所述生長素任一種放于反應(yīng)管中進行酶促反應(yīng)，即可催化合成相應(yīng)的生長素糖酯。本發(fā)明的公開為利用酶催化方法高效、專一性地合成這些生長素物質(zhì)的糖酯物提供了可行的方法，本發(fā)明實施后將為生長素糖酯合成工業(yè)帶來巨大經(jīng)濟效益。
文檔編號C12P19/18GK102796786SQ20121033543
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者侯丙凱, 金尚卉 申請人:山東大學(xué)