p53基因突變的快速檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種p53基因突變的快速檢測方法，本發明分別設計了p53第6號外顯子（p53-E6）和第8號外顯子（p53-E8）的野生型引物和突變型引物，分別擴增對應的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進行區分；與其它方法相比，本發明方法具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優點；而且通量更高，單次成本更低。
【專利說明】P53基因突變的快速檢測方法
【技術領域】:
[0001]本發明涉及生物技術和醫學領域，尤其是分子生物學，分子診斷，實時定量PCR技術。
【背景技術】:
[0002]P53基因位于人17號染色體17pl3.1上，全長約20Kb，由11個外顯子和10個內含子組成，其中第I個外顯子不編碼，外顯子2、4、5、7、8分別編碼5個進化上高度保守的結構域。P53基因編碼一個393個氨基酸殘基組成的蛋白質，分子量為53KD，這也是其被命名為“P53”的原因。
[0003]野生型P53蛋白(wtP53)具有調節細胞生長的功能，多個途徑抑制腫瘤的發生:
[0004]①「滯細胞周期P53蛋白通過調控下游基因P21編碼蛋白，引起細胞Gl期阻滯；此外，P53蛋白通過細胞周期蛋白BI (Cyclin BI)、壓力響應蛋白(CADD45)和14-3-3 σ三個下游基因，將細胞周期阻滯在G2/M期。
[0005]②「促進細胞凋亡；Ρ53蛋白可以上調B-細胞淋巴瘤/白血病-2相關蛋白(Bcl-2associated X protein, Bax)的表達并下調B_細胞淋巴瘤/白血病_2(Bcl_2)的表達,介導細胞色素C的釋放，促進細胞凋亡；此外，P53蛋白可以通過腫瘤壞死因子(TNF)受體和死亡相關因子(factor associated suicide, Fas)蛋白等死亡信號受體蛋白途徑誘導凋亡。
[0006]③「維持基因組穩定P53可參與DNA的修復過程，其DNA結合結構域本身具有核酸內切酶的活性，可切除錯配核 苷酸，結合并調節核苷酸內切修復因子著色性干皮病B基因(XPB)和(著色性干皮病D基因)XPD的活性，影響其DNA重組和修復功能。
[0007]④「抑制腫瘤血管生成P53蛋白能刺激抑制血管生成基因Smad4(drosophilamothers against decapentaplegic protein)等表達，抑制腫瘤血管形成。P53蛋白通過多途徑來抑制腫瘤的發生與發展，在腫瘤抑制上發揮及其重要的作用。
[0008]P53突變的類型包括基因片段缺失、插入、點突變引起的錯義突變以及雜合性缺失。但是在所有P53突變形式中，占主導地位的還是因點突變引起的錯義突變，其比例約占總體的80%。而在這些P53錯義突變中，發生在DNA結合域(DNA binding doma in, DBD區)的點突變比例高達97%。這些突變中，以下6個位點的突變在腫瘤中高頻率出現。與腫瘤進程密切相關的，被稱為熱點突變，分別是:R175、G245、R248、R249、R273和R282 (圖
O[l]o這些突變型P53蛋白(mutP53)的功能發生了逆轉式的改變。一方面，mutP53喪失了原有的細胞周期阻滯、誘導凋亡發生、介導細胞衰老、維持基因組穩定和錯配DNA修復等抑癌功能。同時，mutP53在腫瘤發生與轉移中發揮重要作用[2]。另一方面，mutP53獲得了癌基因特性[3]。mutP53通過調節其表皮生長因子受體(Epidermal growth factorreceptor, EGFR)、增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、禽類髓細胞病毒癌基因(c-myc)等下游靶基因，參與到腫瘤的物質代謝、生長調節、血管生成以及耐藥性的增強中。并與P63、p73等發生可能性結合，損害p63和p73介導的轉錄活化和凋亡的執行，削弱了 P63和p73的抑癌功能。此外，mutP53干擾MRN-ATM通路的信號轉導，衰減轉化生長因子-β (transforming growth factor-β ,TGF-β )通路的信號轉導，促進腫瘤的發生。
[0009]P53基因的這些位點的突變與大部分腫瘤的發生相關，包括肺癌、卵巢癌、膀胱癌、結直腸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、骨肉癌、白血病、乳腺癌和食管癌等，這些位點上的突變是細胞惡性轉化及可能的腫瘤產生的預兆，應引起高度重視。因此，關于P53基因的這些位點的突變的檢測有著非常重要的作用。
[0010]眾所周知，高分辨熔解曲線(high-resolution melt, HRM)分析技術是近幾年來在國外興起的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學分析方法。它是一種高效穩健的PCR技術，不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR (Polymerase ChainReaction)即聚合酶鏈式反應結束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作簡便快速，使用成本低，結果準確，實現了真正的閉管操作，HRM技術受到普遍關注。而，高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統的熔解曲線分析的延伸:它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR與專門的分析算法；使我們可以不必測序直接篩查PCR擴增產物中是否存在遺傳學變異(SNPs，mutations)。SYBR Green I對PCR擴增有毒性，因此必需使用低濃度的染料，又因為它是非飽和態結合，染料在熔解過程中可重新結合，使其無法適用于HRM。
[0011]與此同時，羅氏開發了一種新的適用于HRM的染料ResoLight或LC Green,它有三個優點:1、飽和染料毒性低；2、濃度可以使DNA達到飽和；3、降低了染料位置重組的可能。而，PCR (Polymerase Chain Reaction)產物的高分辨率熔解曲線HRM的要求:儀器:高分辨率高、均一性的儀器，確保結果差異僅受DNA模板的影響；試劑:穩定可靠的PCR與HRM染料，確保獲取高分辨率熔解曲線；軟件:高分辨率熔解曲線分析專用軟件。羅氏熒光定量PCR系統LghtCycler Nano System具有光源好、溫控好、檢測好、加熱快的優點，完全能滿足檢測的要求，這臺儀器也于近期通過了國家藥監局的審批，適用于臨床診斷檢測。LightCycler Nano System 是` LightCycler 480System 的縮小版,LightCyc ler? 480 在HRM領域發表的文獻是當前發表文獻最多的實時定量PCR系統:應用領域包括人類疾病、植物、微生物、病毒、藥理、毒理、生理、診斷等影響因子10分以上5篇，包括Nature，NatureMethods, Nature Genetics,影響因子5 — 10分10篇，5分以上文章占總數的18%逐年上升趨勢明顯，已經成為當前qPCR擴展應用的熱點目前常常使用測序法來檢測是否存在突變，但是總結下來，現有的測序法有三個缺點:
[0012]第一:靈敏度不高，低比例突變(< 20%)無法檢測；
[0013]第二:耗時長，一般需要2-3天；
[0014]第三:成本高。
[0015]鑒于以上的問題，一種靈敏度高、耗時短、成本低、可操作性能更高的實p53基因突變的快速檢測方法的發明是勢在必行的。
【發明內容】
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[0016]本發明要解決的技術問題主要是:現有的測序法有三個缺點:第一:靈敏度不高，低比例突變(< 20%)無法檢測；
[0017]第二:耗時長，一般需要2-3天；[0018]第三:成本高。
[0019]為了解決以上問題，本發明技術在突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物，兩者分別擴增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物以兩個突變片段為模板進行PCR擴增，得到突變型模板，PCR產物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型(Tm的不同):PCR產物的Tm取決于GC含量.[0020]高Tm G:C>A:T>G:G>G:T=G:A > T:T=A:A>T:C>A:C>C:C 低 Tm
[0021]純合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；當然，包括野生型純合子或突變純合子。
[0022]雜合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線.[0023]S卩，為解決上述技術問題，本發明提供了一種p53基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下實現步驟:
[0024]在P53基因突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物；
[0025]分別擴增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物以兩個突變片段為模板進行PCR擴增，得到突變型模板，，擴增對應的突變型模板；
[0026]不同比例混合野生型模板和突變型模板，用HRM方法進行區分。
[0027]所述PCR產物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產物的Tm取決于GC含量.[0028]所述高Tm G:C>A:T>G:G>G:T=G:A > T:T=A:A>T:C>A:C>C:C 低 Tm。
[0029]所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線.[0030]所述不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片 段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進行區分。
[0031]分別設計了 p53第6號外顯子(p53_E6)和第8號外顯子(p53_E8)的野生型引物和突變型引物。
[0032]所述的一種p53基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟:樣本處理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；DNA提取:取200 μ L抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測；
[0033]qPCR-HRM檢測，包括:對照孔的設立和檢測重復孔；10 μ L反應體系構成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統-LightCycler Nano儀器中進行程序性檢測；結果分析及判定:在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對照孔的判定為突變型，差異小于陽性對照孔的判定為野生型。
[0034]所述qPCR-HRM檢測的程序包括:95°C變性10分鐘；95°C變性10秒鐘；退火采用探底式，設置探底退火溫度為55-65°C，每個循環降低1°C，時間為10秒鐘；72°C延伸30秒鐘；重復第2步到第四步45個循環；95°C變性60秒鐘；40°C變性60秒鐘；設置高分辨率熔解溫度從60°C到95°C，緩變率是0.050C /s)。
[0035]所述p53-E6突變型模板的獲取包括:[0036]利用帶有突變位點的突變引物獲得突變位點前后兩段突變片段；
[0037]將這兩段突變片段連接起來，構成p53-E6突變型模板。
[0038]所述野生型模板的獲取包括:以已知未突變基因組為模板，P53-E6 F+p53_E6R為引物進行實驗，獲得條帶單一的特異性野生型模板；將目的片段稀釋至I萬-10萬倍，終濃度約為IOng/μ L，作為檢測野生型陰性對照模板用。
[0039]本發明的有益效果是:本發明分別設計了 ρ53第6號外顯子(Ρ53-Ε6)和第8號外顯子(Ρ53-Ε8)的野生型引物和突變型引物，分別擴增對應的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進行區分，采用了高分辨率熔解曲線法(HRM法)；與其它方法相比，本發明的HRM法能檢出0.1 %的突變、檢測時間只需要I小時、每樣品試劑耗材成本〈Υ7.00，即，本發明方法具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優點；而且通量更高，單次成本更低。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0040]圖1為本發明Ρ53蛋白功能域及熱點突變位點示意圖；
[0041]圖2為用野生型引物檢測ρ53第6號外顯子(ρ53-Ε6)1/10、1/100、1/1000突變型和野生型模板的HRM圖；
[0042]圖3為用野生型引物檢測ρ53第6號外顯子(ρ53_Ε8)1/10、1/100、1/1000突變型和野生型模板的HRM圖；
【具體實施方式】:
[0043]本發明應用于生.物技術和醫學領域，尤其是分子生物學，分子診斷，實時定量PCR技術。
[0044]如圖1-3所不,本發明分別設計了 ρ53第6號外顯子(ρ53_Ε6)和第8號外顯子(Ρ53-Ε8)的野生型引物和突變型引物，分別擴增對應的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進行區分。下面以ρ53-Ε6為例，說明具體的操作。
[0045]1、樣本處理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存。
[0046]2、DNA 提取:取 200 μ L 抗凝血用 QI Amp DNA Blood Mini Kit 試劑盒提取 DNA。采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測。
[0047]3、qPCR-HRM 檢測的體系:
[0048]I)對照的設立和檢測重復孔
[0049]每個樣本的檢測必須同時設有對照實驗，包括野生型陰性對照和m/w (突變/野生=1%)陽性對照。對照和樣本均采用復孔。
[0050]2) 10 μ L反應體系構成(引物序列見附表)
[0051]
【權利要求】
1.一種p53基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下實現步驟: 在P53基因突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物； 分別擴增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物對兩種突變型片段進行PCR擴增，擴增對應的突變型模板； 不同比例混合野生型模板和突變型模板，用HRM方法進行區分。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR產物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產物的Tm取決于GC含量。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述不同比例混合這兩種模板，使突變型模板的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進行區分。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:分別設計了p53第6號外顯子(p53-E6)和第8號外顯子(p53-E8)的野生型引物和突變型引物。
6.根據權利要求1所述的一種P53基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟: 樣本處理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存； DNA提取:取200 μ L抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測；` qPCR-HRM檢測，包括:對照孔的設立和檢測重復孔；10μ L反應體系構成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統儀器中進行程序性檢測； 結果分析及判定:在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對照孔的判定為突變型，差異小于陽性對照孔的判定為野生型。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM檢測的程序包括:95°C變性10分鐘；95°C變性10秒鐘；退火采用探底式，設置探底退火溫度為55-65°C，每個循環降低1°C，時間為10秒鐘；72°C延伸30秒鐘；重復第2步到第四步45個循環;95°C變性60秒鐘；40°Co 變性60秒鐘；設置高分辨率熔解溫度從60°C到95°C，緩變率是0.050C /s)。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述P53-E6突變型模板的獲取包括:利用帶有突變位點的突變引物獲得突變位點前后兩段突變片段；將這兩段突變片段連接起來，構成P53-E6突變型模板。
9.根據權利要求1或6任一所述的方法，其特征在于:所述野生型模板的獲取包括:以已知未突變基因組為模板，P53-E6 F+p53-E6 R為引物進行實驗，獲得條帶單一的特異性野生型模板；將野生型模板稀釋至I萬-10萬倍，終濃度約為IOng/ μ L，作為檢測野生型陰性對照模板用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436593SQ201210335283
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年9月11日 優先權日:2012年9月11日
【發明者】王明, 彭南求 申請人:上海賽安生物醫藥科技有限公司