專利名稱：一種耐高溫阿拉伯多糖酶及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術及生物質精煉技術領域，具體涉及一種耐高溫阿拉伯多糖酶及其編碼基因和應用。
背景技術：
阿拉伯多糖是L-阿拉伯糖以α-1，5-糖苷鍵連接組成的的中性多糖。它們通常聚合度較低(40-50)，輔以α-1,3或少量的α-1，2糖苷鍵相連的分支結構，能從花生、蘋果和甜菜等植物組織中分離獲得。阿拉伯多糖酶是半纖維素降解酶系中的一種多糖水解酶，通過隨機切阿拉伯多糖的α-1，5-糖苷鍵，將阿拉伯多糖水解為L-阿拉伯糖。臨床研究表明，L-阿拉伯糖對蔗糖的代謝轉化具有阻斷作用，因此在減肥、控制糖尿病等方面具有重要應用前景。
發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種耐高溫阿拉伯多糖酶，以使其滿足使用要求。本發明的另一目的是提供一種編碼上述耐高溫阿拉伯多糖酶的核苷酸序列。本發明還有一目的是提供上述一種耐高溫阿拉伯多糖酶的應用。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種耐高溫阿拉伯多糖酶，氨基酸序列如SEQ NO 1所示。一種耐高溫阿拉伯多糖酶，其特征在于氨基酸序列為權利要求I所述的SEQ NO I序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯多糖酶活性的衍生蛋白質。一種編碼耐高溫阿拉伯多糖酶的基因，DNA序列如SEQ NO 2所示。一種可表達耐高溫阿拉伯多糖酶的重組載體，在所述的重組載體上克隆有如SEQNO 2所示的DNA序列。一種可表達耐高溫阿拉伯多糖酶的重組菌，在所述的重組菌內克隆有如SEQ Ν02所示的DNA序列。一種擴增編碼耐高溫阿拉伯多糖酶的基因的方法，所使用的引物對為Tth_l 5’ -GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3，。所述的耐高溫阿拉伯多糖酶在酶解阿拉伯多糖中的應用。酶解反應溫度為60^85°C, pH為6. 0 8· O的反應體系。耐高溫阿拉伯多糖酶在降解水果蔬菜和纖維原料中的應用。上述的重組載體或重組菌在酶解阿拉伯多糖中的應用。有益效果與現有技術相比，本發明所提供的阿拉伯多糖酶具有極強的耐熱性能和偏中性PH條件下高活性的特性。在75°C、pH為6. 5的條件下酶活性最高，比酶活達到16. 7 U/mg ;該蛋白酶在溫度為60°C _85°C、pH為6. 0-8. O的范圍內，均具有較高的酶活，在750C的反應體系中，保溫2h酶活性保持不變。這些特性使得本發明得到的阿拉伯多糖酶比現有阿拉伯多糖酶具有更大的優越性，適用于75V以上高溫、偏中性pH條件下水果、蔬菜及半纖維素中阿拉伯多糖的降解，具有潛在的工業應用價值。
圖I 是 Tth arase 蛋白的 SDS-PAGE 圖2是Tth arase蛋白的最適溫度結果 圖3是Tth arase蛋白的最適pH結果 圖4是Tth arase蛋白的熱穩定性結果圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。實施例I嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌基因組DNA的提取
取嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌thermarum DSM5069 (購自德國微生物菌種保藏中心)新鮮菌體10g，懸于5mL 50mM Tris緩沖溶液中(pH8. 0)，混勻后，在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55°C放置5min，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30 min, 4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀。沉淀溶于 O. 5mL TE 緩沖液(ρΗ8· 0，IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3μ L,37°C保溫lh，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000 rpm離心20min，收集沉淀，真空冷凍干燥，用O. 5mL超純水溶解，備用。實施例2阿拉伯糖基因Tth arase的制備
可采用如下方法制備Tth arase基因，也可以采用人工合成的方式得到。認Thermotoga thermarum DSM5069的總DNA (實施例I制備)為模版，用下述引物對進行PCR擴增
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3 ；
在Tth-I引入Nde I酶切位點，在Tth-2引入Xho I酶切位點。PCR 反應體系1 μ L T1. iAerfflara 基因組 DNA, I μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超純水。PCR 反應條件94°C變性 5 min ;94°C變性 30 sec，52°C退火 30 sec，72°C延伸 3min, 30 Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保溫。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產量和特異性，并用PCR產物回收試劑盒進行純化(BI0MIGA，上海)。實施例3重組克隆、表達載體pET-20b-TiA arase的構建與驗證
將純化過的PCR產物(實施例2制備)、pET-20b (Novagen)用分別Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收后的目的片段與載體，經濃縮加入8μ L無菌水重懸，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應產物轉化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養皿，37°C培養 10-12h。從轉化平板上挑取多個單菌落，采用BI0MIGA的質粒小量提取試劑盒提取質粒。對獲得的質粒雙酶切驗證并對獲得的重組質粒進行測序。測序結果顯示，pET-20b載體中插入了所克隆的目的片段(核苷酸長度為1341bp)，進而得到重組克隆及表達載體pET-20b-7iA arase,Tth arase的核苷酸如SEQ NO :2所示,其編碼的氨基酸序列如SEQ NO:I所示，將該蛋白命名為Tth arase。實施例4重組阿拉伯糖Tth arase的表達與純化
按常規方法將重組克隆、表達載體pET-20b-RA arase電轉至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，獲得含有重組質粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5mL含有100 μ g/ml氨節青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養基,在37°C溫度下,200rpm震蕩培養8-12h。將上述4mL菌液接種于含400mL培養基的IOOOmL搖瓶中，37°C溫度下，200rpm 震蕩培養，當吸光度達到O. 6-0. 8時，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導表達10-12 h。用高速冷凍離心機將培養液在4°C下，13000rpm離心15min，收集菌體。用50mL超純水洗漆并在4°C下，以13000 rpm離心15min,回收菌體,接著用20mL I XBindingBuffer 重懸(O. 5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超聲波破碎機破碎細菌細胞，并在4°C下13000rpm離心15min,得到含阿拉伯多糖酶Tth arase的粗提液。粗提液先經70°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用Ni-NTA親和層析柱進行純化(方法見His-Bind Kits,Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測定采用SDS-PAGE方法進行，結果見圖1，1為pET-20b空質粒表達出的蛋白，2為200mM咪唑純化過后的蛋白，3即表示400mM咪唑純化過后的Tth arase蛋白，分子量約為43kDa，略比理論值49kDa低。實施例5重組阿拉伯糖Tth arase的酶學性質分析
酶活定義為=Imin內催化甜菜阿拉伯多糖產生Iymol阿拉伯糖所需的酶量。( I)最適溫度
用PH值為6. 5的O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施4中的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。酶活測定反應體系為200 μ L，由O. 2%甜菜阿拉伯多糖100 μ L，90 μ LO. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成；反應體系的pH為6. 5。將反應體系在60-100°C溫育10 min后，加入300μ L DNS試劑終止反應，沸水浴5min后測定550nm的吸光值。實驗設3次重復，取平均值作圖，結果如圖2所示，研究結果表明在75°C時，阿拉伯多糖酶具有最高的酶活性，為16. 7U/mg ;將此溫度下的酶活反應體系的吸光值最為相對活性100%，其它溫度下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性。其中，在溫度60-85°C的反應體系中酶活性較高。(2)最適 pH
酶活性測定體系為200 μ L，由O. 2%甜菜阿拉伯多糖100 μ L，pH4. 0-8. O的90 μ L O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成。將反應體系在75°C溫育IOmin后，加入300 μ L DNS試劑終止反應，沸水浴5 min后測定550nm的吸光值。實驗設3次重復實驗，取平均值，結果如圖3所示，研究結果表明，在pH為6. 5時，阿拉伯多糖酶具有最高的酶活性，為16. 7U/mg ;將此pH值下的酶活反應體系的作為相對活性100%，其它pH值下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對活性。在PH6. 0-8. O的條件下，酶活較高。 (3)重組酶熱穩定性
用PH值為6. 5的O. I M咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施例4中的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。將稀釋酶液在75°C、80°C、85°C、9(TC水浴30min、60min、90min和120min，測定酶的殘存酶活。酶活測定反應體系中pH為6. 5，測定溫度為80°C。實驗設3次重復，取平均值，結果如圖4所示，研究結果顯示，75°C處理2 h未見酶活下降，可見該阿 拉伯多糖酶在75°C條件下熱穩定非常好，可以快速有效地將甜菜阿拉伯多糖降解為阿拉伯糖。
權利要求
1.一種耐高溫阿拉伯多糖酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ NO 1所示。
2.一種耐高溫阿拉伯多糖酶，其特征在于氨基酸序列為權利要求I所述的SEQ NO 1序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯多糖酶活性的衍生蛋白質。
3.一種編碼權利要求I所述的耐高溫阿拉伯多糖酶的基因，其特征在于DNA序列如SEQ NO 2 所示。
4.一種可表達耐高溫阿拉伯多糖酶的重組載體，其特征在于在所述的重組載體上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列。
5.一種可表達耐高溫阿拉伯多糖酶的重組菌，其特征在于在所述的重組菌內克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列。
6.一種擴增編碼耐高溫阿拉伯多糖酶的基因的方法，其特征在于所使用的引物對為Tth-l :5’ -GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3，。
7.權利要求I所述的耐高溫阿拉伯多糖酶在酶解阿拉伯多糖中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于酶解反應溫度為6(T85°C，pH為6.(Γ8. O的反應體系。
9.權利要求4所述的重組載體在酶解阿拉伯多糖中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種耐高溫阿拉伯多糖酶及其編碼基因和應用，該阿拉伯多糖酶的氨基酸序列如SEQNO1所示。該阿拉伯多糖酶具有極強的耐熱性能和偏中性pH條件下高活性的特性。在75℃、pH為6.5的條件下酶活性最高，比酶活達到16.7U/mg；該蛋白酶在溫度為60℃-85℃、pH為6.0-8.0的范圍內，均具有較高的酶活，在75℃的反應體系中，保溫2h酶活性保持不變。這些特性使得本發明得到的阿拉伯多糖酶比現有阿拉伯多糖酶具有更大的優越性，適用于75℃以上高溫、偏中性pH條件下水果、蔬菜及半纖維素中阿拉伯多糖的降解，具有潛在的工業應用價值。
文檔編號C12N15/63GK102864131SQ20121033385
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者王飛, 時號, 李迅, 丁懷海 申請人:南京林業大學