專利名稱：一種血清microRNAs試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術制藥領域,具體涉及ー種血清microRNAs試劑盒及其應用。
背景技術：
宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，是指發生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤。宮頸癌的發病率僅次于乳腺癌，居于女性腫瘤發病率的第二位，全球每年約有50萬宮頸癌新發病例，占所有癌癥新發病例比重高達5%，我國毎年新發宮頸癌病例約為13. 2萬，屬于高發區。宮頸癌的死亡率也很高，全球每年約有23萬女性死于宮頸癌，我國每年約有3萬女性死于宮頸癌。采取有效的診斷方法，早期診斷早期治療，能夠有效降低癌癥的發生率，提聞治愈率。MicroRNAs (miRNA)是ー類長度約為22nt的非編碼單鏈小分子RNA，miRNA基因以 單拷貝、多拷貝或基因簇等形式存在于基因組中，并且大部分定位于基因間隔區，在進化上高度保守，MiRNA的轉錄獨立于其他基因，不具有開放閱讀框(ORF)所以不翻譯成蛋白質，而是在體內多種生理過程中起到調控作用，包括細胞増殖、分化、凋亡等。本實驗室前期通過系統的研究發現miRNAs穩定地存在于哺乳動物的血清中。血清中穩定存在多種miRNA的發現也引起了人們對其來源和產生方式的研究和探索。目前認為血清中的miRNA與相關組織的分泌密切相關。MiRNAs具有內在的調控基因表達的功能，提不那些在腫瘤中特異性表達的miRNAs可能在腫瘤的發生和發展的過程中發揮特殊的作用，近期，在對腫瘤患者血清miRNAs變化機制的研究中發現，在腫瘤中高表達的miRNA可能發揮與癌基因相似的作用，而在腫瘤中低表達的miRNA可能與抑癌基因有相似的作用，這對于腫瘤的臨床診斷、治療方案的選擇和預后具有指導意義。與組織檢測方法相比，以血清作為檢測樣本具有取材方便、基本無創傷性、可連續體外檢測等優點。構建腫瘤特異性血清microRNA表達譜，有望成為ー種基于血清檢測癌癥的分子標記。
發明內容
本發明的需要解決的問題是通過檢測宮頸癌血清中miRNA的表達水平，篩選并鑒定能夠作為宮頸癌檢測標志物的血清miRNAs,進行血清miRNA檢測試劑盒的研制。I.本發明首先在基因組范圍內通過solexa測序篩選出在正常人和患者血清中表達存在明顯差異的ー組miRNAs ;然后利用RT-qPCR法進行了兩個階段獨立樣本的復篩和驗證；最后利用ROC曲線法分析其靈敏度和特異性。2.血清采集均嚴格按照如下步驟進行收集患者和正常人全血，在室溫下3000g離心IOmin去除血細胞并收集血清，然后將收集的血清在4°C條件下，12000g離心15min，進一歩去除殘留的血細胞，離心后收集血清置于-80°C冰箱保存待用。3. ー組由5種血清miRNAs組成的宮頸癌血清診斷標志物，分別是miR-21,miR-29a, miR-200a, miR-25和miR-486_5p。ROC曲線分析結果顯示，對比傳統血清SCC和CA125檢測，血清miRNAs標志物具有高靈敏度和特異性。本發明與現有技術相比其有益效果是篩選出的疾病特異血清miRNA，進行血清miRNA檢測試劑盒的研制，該芯片可以識別宮頸癌病人的發病及分級情況，實現宮頸癌早期診斷的目的。本發明的主要創新點包括血清miRNA是ー種新型生物標志物；血清miRNA監測是一種系統、全面的檢測試劑盒，與組織檢測方法相比，以血清作為檢測樣本具有取材方便、基本無創傷性，本發明采用嚴密、多階段的驗證和評價體系。四
圖I為5種血清miRNAs在宮頸癌患者和正常人中表達存在明顯差異；
圖2由5種血清miRNAs組成的宮頸癌標志物的ROC曲線分析結果 圖3為本發明實驗設計流程 五具體實施方式
I、進行Solexa測序實驗時，我們分別混合了 20例宮頸癌患者(每人2ml)和20位健康對照(每人2ml)的血清。每組混合血清的總RNA是嚴格按照Trizol LSReagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)的人工操作指南提取的。I) 將收集的血清樣本包括AMI組和正常對照組的血清分別進行混合，得到兩組混合血清，體積均為40 ml，分別提取混合血清RNA。2) 按混合血清體積(均為40 ml) 2:1的比例加入TRIzol，用力震蕩均勻后，室溫靜置15min，然后加入TRIzol 1/5體積的氯仿，用力震蕩均勻，室溫靜置15min。3) 靜置結束后10000 g，4°C，離心15 min，離心畢收集上清。4) 將3)中收集的上清置于除酶管子中，加入上清等體積的水飽和酚，用カ震蕩均勻后 10000 g，4°C，離心 5 min。5) 離心畢，收集上清,加入上清1/2體積的水飽和酚和1/2體積的氯仿，用力震蕩均勻后10000 g,4°C,離心5 min。6) 離心畢，收集上清，加入上清等體積的氯仿，用力震蕩均勻后10000 g，4°C，離心5 min。7) 離心畢，收集上清，加入上清等體積的異丙醇，用力震蕩均勻后在冰上沉淀I h 后 10000 g，4°C，離心 30 min。8) 離心畢，去上清，留沉淀，先用3 ml 75%的こ醇逐個清洗管子，然后用3 ml的TRIzol清洗こ醇洗滌后的管子。こ醇清洗后分裝到除酶的2 ml的離心管后12000 g，4°C，離心 15 min。9) 離心畢，取沉淀，用8)中洗管壁的TRIzol分別再次完全溶解沉淀，加入Trizol 1/5體積的氯仿,混勻室溫靜置10 min后12000 g,4°C,離心15 min。10)離心畢，取上清，加入上清等體積異丙醇，冰上靜置15 min后12000 g，4°C，離心 15 min。11)離心畢，去上清，留沉淀，用I ml 75%的DEPCこ醇加入沉淀中渦漩后12000g, 4°C,離心 15 min。12)離心畢，去上清，留沉淀，待沉淀干燥后加50 ul DEPC水至RNA完全溶解，測定RNA濃度。
2、在做RT-qPCR實驗吋，我們用酚/氯仿抽提法在200 U I血清中提取RNA。13)將250 U I血清放入已除酶的I. 5 ml離心管中，加入250 U I DEPC水稀釋，渦旋混勻。14)混勻畢,加入250 U I水飽和酹并劇烈震蕩,室溫靜置兩分鐘,然后加入250U I氯仿，劇烈震蕩在室溫靜置5 min后4°C，12000 g，離心5 min。15)離心畢，取上清，加入上清1/10體積的醋酸鈉溶液(C=3M/L，pH=5. 3)并加入上清兩倍體積的異丙醇，渦旋混勻后_20°C靜置30 min,4°C, 12000 g離心20 min。16)離心畢，去上清，留RNA沉淀，加入I ml 75% DEPCこ醇，渦旋混勻，洗滌RNA沉淀，洗滌畢4°C，12000 g，離心20 min。17)離心畢，去上清，留沉淀，在室溫下晾干沉淀約10 min后加入20 DEPC水， 溶解RNA沉淀。待RNA完全溶解之后放入_80°C低溫冰箱留存待用。3、本文使用 TaqMan探針引物(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)利用RT-qPCR技術定量分別檢測特異性miRNA和基因的表達。針對每一 miRNA均設計了ー個含相同莖環結構(stem-loop structure)的基因特異性反向引物,將所有的基因特異性反向引物混合，再進行逆轉錄，就可以得到含相同莖環結構的總cDNA混合物，最后再進行PCR反應。莖環結構設計可以杜絕基因特異性反向引物之間的非特異性反應的干擾，同時由于莖環序列一致，所以PCR時反向引物是通用的，正向引物則要拖長ー個尾巴以增加Tm值，通過這些實驗設計的輔助，就可以成功擴增22bp左右的成熟體miRNA 了。
權利要求
1.ー種血清microRNAs試劑盒，其特征是由5種血清miRNAs組成的宮頸癌血清檢測標志物，5 種標志物為 miR-21, miR-29a, miR-200a, miR-25 和 miR-486_5p。
2.權利要求I所述血清microRNAs試劑盒在宮頸癌細胞檢測中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物技術制藥領域，具體涉及一種血清microRNAs試劑盒及其應用。本發明在基因組范圍內通過solexa測序篩選出在正常人和患者血清中表達存在明顯差異的一組miRNAs，然后利用RT-qPCR法進行了兩個階段獨立樣本的復篩和驗證,篩出了由5個miRNAs(miR-21,miR-29a,miR-200a,miR-25和miR-486-5p)組成的宮頸癌血清指紋譜。本發明通過ROC曲線分析，發現篩選出的這組血清miRNAs標志物對于診斷宮頸癌具有較高的靈敏度和特異性。由此制備了一種能用于宮頸癌早期檢測的診斷試劑盒。所述組合、方法能夠用于宮頸癌的早期檢測，具有高特異性、高效性、高靈敏度、檢測成本低、取材方便、樣本易存放等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102864224SQ20121033365
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者項陽, 吳元赭, 賈文慧, 張辰宇, 張秦 申請人:南京大學