專利名稱：一種新生豬胰島細胞培養基及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種新生豬胰島細胞培養基及其使用方法。
背景技術：
目前的豬胰島細胞培養體系就是從動物體中取出胰腺分離出胰島細胞，并將其培養于CMRL1066，RPMI等培養基內維持其生長或誘導其定向分化的過程，培養的胰島細胞一般用于移植手術治療糖尿病。現今有多種新生豬胰島細胞培養方法，一般采用1-5天的新生豬，解剖取胰腺，破碎后用膠原酶消化成細胞團，置于細胞培養基中培養3-5天，但純化獲得的有活性功能胰島細胞的量各不相同(2000IEQ/g-4000IEQ/g)，培養胰島細胞的純度也各有差別(70-90%)。胰島細胞即使在低溫培養中也會因細胞凋亡而產生丟失，尤其是β 細胞，并且培養過程長短難于選擇，培養時間短則β細胞不能發育成熟，培養時間過長則會有大量胰島細胞因凋亡產生丟失，一般回收率只有60%左右，且由于β細胞凋亡使得同等量胰島細胞胰島素分泌量減少(insulin/DNA值為49. 00 ± I. 95mIU/g)。培養過程難于清除污染，易于給后續的移植過程帶來炎癥反應。現今沒有能大量提供高純度有活性并且穩定產量的胰島細胞培養方法，所以如何通過建立優化的培養基成分以及培養方式成為胰島細胞培養最迫切的問題。
發明內容
本發明旨在建立一種改良的能大量提供有活性并且有穩定產量的新生豬胰島細胞培養體系。本發明的新生豬胰島細胞培養基為，向HAM’ S/F-10培養基中添加細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK 10微摩爾 50微摩爾，占培養基體積百分比15% 25%的人血白蛋白和占培養基體積百分比為5% 15%豬血清，以及每升培養基中加入6 IOmmol的丙酮酸鈉。優選的是人血白蛋白為20% ;所述的豬血清為10%，所述的丙酮酸鋼為8mmol。本發明使用過程是，室溫無菌條件下，將已分離純化的(5000 10000IEQ)豬胰島細胞懸液加入本發明所述的培養基中，在37°C、5%C02、95%空氣培養箱內培養，制備的細胞在第一天更換培養皿及培養基，此后每隔一天更換一次。該優化培養基降低了細胞凋亡率，增加了培養細胞回收率，延長了細胞培養時間，使得培養后胰島細胞較短時間培養的更為成熟，相同量胰島細胞的胰島素分泌量顯著提升，建立了穩定高效，細胞獲得量大的長期胰島細胞長期培養體系。細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK，分子式為 Z-Val-Ala-Asp-CH2F,即 C21H28FN3O7,分子量為 453. 5，純度 >95%。與以往技術相比的有益效果I細胞凋亡下降，回收率增加。2培養時間延長，培養細胞有敏感葡萄糖刺激應答，功能比一般培養的胰島細胞要成熟。
3相同量的胰島細胞胰島素分泌量增加。4胰島β細胞活力增加。
具體實施例方式本發明針對已分離純化的新生豬胰島細胞懸液含10000IEQ(IEQ為胰島當量，按細胞團大小來計算)，將所述的懸液加入培養基HAM’ S/F-10 (從thermo公司購得)、10%豬血清、0. 1%谷氨酰胺、80U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素，并且添加有Z-VAD-FMK 10微摩爾 50微摩爾(上海碧云天生物技術有限公司購得)、20%人血白蛋白、SmM丙酮酸鈉的培養皿。置于37°C、5%C02、95%空氣培養箱內培養，制備的細胞在第一天更換培養皿及培養基，此后每隔一天更換一次，于培養第10天時收集細胞計數并做相關檢測。細胞計數檢測方法為 常規臺盼藍(分子式C34H24N6014S4Na4)染色(細胞懸液同4%臺盼藍液體比例為9 :1)，將27 μ I細胞懸液和3μ I臺盼藍溶液混合，滴入市售的細胞計數板顯微鏡下計數，計數方法為一般光學顯微鏡下目測細胞計數板上四個對角上四個大正方形方格(由16個小正方形方格組成)中的細胞數，求平均數X，總細胞數為ΧΧ100000Χ細胞培養液總數。本發明分離純化后胰島獲得量平均值為17805±2171.47IEQ/胰腺，即12187. 41 ±2653. 182IEQ/g胰腺。本發明通過向HAM’ S/F-10培養基中添加細胞凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK)、20%人血白蛋白、8mM丙酮酸鈉以及10%豬血清，使培養7天的活性胰島細胞回收率達到82%，比一般培養的胰島細胞提高36. 7%。本發明的方法與一般培養(3-6天)培養時間長(10天)，培養10天獲得的胰島細胞對葡萄糖刺激具有敏感應答能力，并且培養10天的胰島細胞中β細胞比例為94. 65%，較一般培養的比例高。另外，insulin/DNA值為(66. 45±2. 17mIU/g)也相對于一般培養的胰島細胞(49. 00 ± I. 95mIU/g)要高,證明本發明培養的胰島細胞胰島素分泌量明顯增多(P〈0. 05)，彌補了一般培養的胰島細胞因凋亡導致胰島素分泌下降的不足。
權利要求
1.一種新生豬胰島細胞培養基，向HAM’ S/F-10培養基中添加細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMKIO微摩爾 50微摩爾，占培養基體積百分比15% 25%的人血白蛋白和占培養基體積百分比為5% 15%豬血清，以及每升培養基中加入6 IOmmol的丙酮酸鈉。
2.根據權利要求I所述的新生豬胰島細胞培養基，所述的人血白蛋白為20%;所述的豬血清為10%,所述的丙酮酸鋼為8mmol。
3.權利要求I或2所述的培養基的使用，將新生豬胰島細胞懸液，置于37°C、5%C02、95%空氣培養箱內培養，制備的細胞在第一天更換培養皿及培養基，此后每隔一天更換一次，培養10天。
4.根據權利要求3所述的培養基的使用，所述的新生豬胰島細胞懸液為5000 10000IEQ。
全文摘要
一種新生豬胰島細胞培養基及其使用方法，所述的培養基是向HAM’S/F-10培養基中添加細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK 10微摩爾～50微摩爾，占培養基體積百分比15%～25%的人血白蛋白和占培養基體積百分比為5%～15%豬血清，以及每升培養基中加入6～10mmol的丙酮酸鈉。本發明是一種改良的能大量提供有活性并且有穩定產量的新生豬胰島細胞培養體系。
文檔編號C12N5/071GK102816733SQ20121033042
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者王維, 易受南 申請人:王維