專利名稱：一種施羅氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種專用于可導致珊瑚發生白化現象的病原弧菌一施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的快速檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術：
施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)是一種海洋弧菌,能夠侵染珊瑚，引起珊瑚的細菌性白化。目前，施羅氏弧菌的檢測方法主要是傳統的微生物分類鑒定方法及依賴于PCR技術的檢測方法。傳統的微生物分類和鑒定方法主要是以微生物的形態學和生理生化等特 性作為判斷依據，雖然結果可信度高，但是繁瑣且費時。現階段采用最多的還是分子生物學的方法，其主要依賴于PCR技術對某些特異性的基因進行擴增。可是這些方法都存在一定的缺陷(I)檢測耗時，過程繁瑣；(2)檢測靈敏度低，檢測出病原菌時往往是發病晚期；檢測的目標基因過于單一，容易漏檢由于環境差異導致的同種不同菌株，不能全面反應該種病原菌的潛在致病性。因此，在做病原細菌的檢測時，只有同時檢測盡可能多的特異基因，才能使檢測結果更加具有可靠性，對病原細菌的鑒定更加準確。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種更為快速準確地評價施羅氏弧菌(Vibrioshilonii)致病性的施羅氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒。本發明的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒，包括PCR反應試劑，多基因PCR引物和GeXP多重擴增反應試劑，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13對多基因PCR引物和一對通用引物，具體如下含有熒光標記的通用引物對序列，可按常規技術將熒光標記加到下述通用引物序列上，所述的熒光標記優選為CY5熒光標記TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，為毒力基因sod(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000140. I)設計的引物，擴增片段大小約為IlObp sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGACTCCACTAACAGA為毒力基因fldA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH0100015l. I)設計的引物，擴增片段大小約為117bp fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfldA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC為毒力基因ompUL(GenBank:EU727214. I)設計的引物，擴增片段大小約為124bp ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTA
ompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS(GenBank:EU727211. I)設計的引物，擴增片段大小約為131bp toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp(NCBIReference Sequence:NZ_ABCH01000011. I)設計的引物，擴增片段大小約為138bp Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA
為毒力基因dnaj (GenBank:ΑΒ263067· I)設計的引物，擴增的片段大小約為145bp dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA (GenBank:NZ_ABCH01000011. I)設計的引物，擴增片段大小約為152bp mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3 (GenBank:AF009900. I)設計的引物，擴增片段大小約為159bp z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000010. I)設計的引物，擴增片段大小約為166bp fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH(GenBank:JN039147. I)設計的引物，擴增片段大小約為173bp pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL(GenBank:EU727208. I)設計的引物，擴增片段大小約為180bp toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAACtoxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA(GenBank:AJ842695. I)設計的引物，擴增片段大小約為187bp rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTGrpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA(GenBank:AJ580887. I)設計的引物，擴增片段大小約為195bp recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA。本發明的第二個目的是提供施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA，以其作為模板，用上述13對多基因PCR引物和I對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產物，利用GenomeLabGeXP遺傳分析系統對多重PCR反應產物進行檢測分析。如果能擴增到相應的PCR產物，則證明該施羅氏弧菌具有相應的毒力基因。本發明的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測方法是用于非診斷目的的。所述的以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為模板，用上述13對多基因PCR引物和I對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產物是以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為模板，用上述13對多基因PCR引物等比例混合，每個引物終濃度為0. 2-2 μ M，再加入通用引物對，終濃度為1-20 μ Μ，混合均勻為引物預混液，其反應體系和程序優選為2(Γ50μ L的PCR反應體系，包括10XPCR Buffer 2 5 μ L，IOmMdNTP I. 6 4μ L，5M/y L 的 TaqE O. 2 O. 5 μ L，引物預混液 O. 2 O. 5 μ L，模板 DNA O. 8 2 μ L，ddH2015 37. 5μ L ;反應程序為94°C 3min ；94°C 30s、59 62°C 50 60s、72°C 100s，25 35 個循環；72°C 7min。 本發明針對已知13個施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的毒力基因，設計特異性引物，利用本發明的檢測試劑盒，按照本發明的方法，可以通過單管反應，一次性快速、高效的同時檢測13種基因，而得知檢測出樣品或環境中是否含有攜帶這些毒力相關基因、具有潛在致病能力的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)，其檢測覆蓋面廣，可大大提高施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)致病性評價的準確性,為施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)致病性評價提供了更為有效的檢測手段，在對珊瑚蟲白化病害的監測、防治方面具有重大的意義。
圖I是實施例I的檢測結果圖；圖2是實施例2的檢測結果圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :(I)提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA首先對珊瑚樣品中的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)進行平板的純化分離,再培養施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。①在離心管中加入50 μ L10%(w/v)無菌Chelex-100溶液；②從施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)培養平板上,挑取單菌落至上述Chelex-100溶液中；③將離心管放置在渦旋混合器上充分震蕩10s，沸水浴lOmin，冷卻至室溫，再充分震蕩IOs ；④12000r/min離心2min,上清液即為施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)基因組DNA,置于-20°C冰箱備用。(2)多基因PCR引物的設計與合成為毒力基因sod(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000140. I)設計的引物，擴增片段大小約為IlObp
sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGACTCCACTAACAGA為毒力基因fldA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH0100015l. I)設計的引物，擴增片段大小約為117bp fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfldA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC為毒力基因ompUL(GenBank:EU727214. I)設計的引物，擴增片段大小約為124bp ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTA
ompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS(GenBank:EU727211. I)設計的引物，擴增片段大小約為131bp toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp(NCBIReference Sequence:NZ_ABCH01000011. I)設計的引物，擴增片段大小約為138bp Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA為毒力基因dnaj (GenBank:AB263067. I)設計的引物，擴增的片段大小約為145bp dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA (GenBank:NZ_ABCH01000011. I)設計的引物，擴增片段大小約為152bp mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3 (GenBank:AF009900. I)設計的引物，擴增片段大小約為159bp z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000010. I)設計的引物，擴增片段大小約為166bp fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH(GenBank:JN039147. I)設計的引物，擴增片段大小約為173bp pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL(GenBank:EU727208. I)設計的引物，擴增片段大小約為180bp toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAACtoxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA(GenBank:AJ842695. I)設計的引物，擴增片段大小約為187bp rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTG
rpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA(GenBank:AJ580887. I)設計的引物，擴增片段大小約為195bp recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA帶有CY5熒光標記的通用引物序列，可按常規技術將CY5熒光標記加到通用引物序列上TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，
·
(3)多重 PCR 擴增(XP-PCR)以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為多重PCR反應的模板，用上述13對多基因PCR引物等比例混合，每個引物終濃度為O. 2 μ M，再加入通用引物對，終濃度為I μ Μ，混合均勻為引物預混液，配制25μ L的PCR反應體系，包括10 X PCR Buffer
2.5μ L, IOmM dNTP 2 μ L，5M/μ L 的 TaqE O. 25 μ L，引物預混液 O. 25 μ L，模板 DNAl μ L，ddH2019y L。將反應物混勻后，放置在PCR儀中，按如下反應循環進行擴增
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62 0C《Os >_ 3 5 cycles
T i100s
72 0CImm得到XP-PCR 產物。(4)產物檢測利用貝克曼GenomeLab GeXP遺傳分析系統對XP-PCR的產物進行檢測分析，具體操作如下①GeXP 上樣a,制備SLS/DSS混合液取DSS 400 (分子量內標-400)，加入80倍體積SLS (上樣緩沖液，甲酰胺)，在渦旋震蕩器上震蕩30S或者用槍頭混勻10次備用；b,在每個樣本孔中加入40 μ I SLS/DSS混合液，再加入O. 01 μ I XP-PCR產物至GeXP樣品板(不要出現氣泡)，加一滴石蠟油覆蓋樣品；C，在緩沖液板與樣本板對應孔內加入3/4體積的分離緩沖液；d,進入Set Mp程序，輸入樣品名，對每個樣本指定Freg-3分離方法,指定默認的GeXP分析方法，開始運行樣本。②GeXP系統操作程序a.調整 GeXP 系統
I’安裝毛細管和凝膠。2’將毛細管溫度調整至50° C。3’按照O. 4ml凝膠，重復3次模式執行初級管路沖洗。4’執行毛細管充膠，重復3次。5’執行光路聚焦。6 ’監控儀器基線，低于4000RF M。b.輸入樣本信息 I’輸入樣本名。2’對每個樣本指定Freg-3分離方法,指定默認的GeXP分析方法。3’保存樣本信息。c. GeXP 樣本分析I’使用蒸餾水清洗水槽。2’放入樣本板和緩沖液板。3’開始運行樣本。d.查看片段分析結果I’打開片段分析模塊；2’使用分析后結果(Analyzed Data)建立一個新的分析(Study)。3’在片段列表(Fragments)窗口中設定過濾參數，過濾非D4染料峰及其他非產物峰。4’確認現有分析結果正確。5’查看片段分析結果。6’對照標準圖譜可以判讀結果，每個峰代表一個基因，結果如圖I所示，圖I中具有13個峰，根據橫坐標size nt數值大小判斷基因，從左到右分別為sod IlObp, fldA117bp, ompUL 124bp, toxS 131bp,bcp 138bp, dnaj 145bp, mshA 152bp,z2z3 159bp, fimA166bp, pyrH 173bp, toxRL 180bp, rpoA 187bp, recA 195bp,由此表明樣品施羅氏弧菌含有這13個毒性因子，這個結果與本實施例的樣品施羅氏弧菌按照常規方法檢查出來的毒性因子相同。可見本發明所提供的方法能快速準確地檢測施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的13種毒性因子，從而能快速準確的評價施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)致病性。實施例2 (I)提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA首先對珊瑚樣品中的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)進行平板的純化分離，再培養施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。①在離心管中加入50 μ L 10%(w/v)無菌Chelex-100溶液；②從施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)培養平板上,挑取單菌落至上述Chelex-100溶液中；③將離心管放置在渦旋混合器上充分震蕩10s，沸水浴lOmin，冷卻至室溫，再充分震蕩IOs ；④12000r/min離心2min,上清液即為施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)基因組DNA,置于-20°C冰箱備用。
(2)多基因PCR引物的設計與合成為毒力基因sod(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000140. I)設計的引物，擴增片段大小約為IlObp sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGACTCCACTAACAGA為毒力基因fldA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000151. I)設計的引物，擴增片段大小約為117bp fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfldA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC 為毒力基因ompUL(GenBank:EU727214. I)設計的引物，擴增片段大小約為124bp ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTAompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS(GenBank:EU727211. I)設計的引物，擴增片段大小約為131bp toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp(NCBI Reference Sequenc e:NZ_ABCH01000011. I)設計的引物，擴增片段大小約為138bp Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA為毒力基因dnaj (GenBank:AB263067. I)設計的引物，擴增的片段大小約為145bp dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA (GenBank:NZ_ABCH01000011. I)設計的引物，擴增片段大小約為152bp mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3 (GenBank:AF009900. I)設計的引物，擴增片段大小約為159bp z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000010. I)設計的引物，擴增片段大小約為166bp fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH(GenBank:JN039147. I)設計的引物，擴增片段大小約為173bp pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL(GenBank:EU727208. I)設計的引物，擴增片段大小約為180bp toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAAC
toxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA(GenBank:AJ842695. I)設計的引物，擴增片段大小約為187bp rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTGrpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA(GenBank:AJ580887. I)設計的引物，擴增片段大小約為195bp recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA 帶有CY5熒光標記的通用引物序列，可以按常規技術將CY5熒光標記加到通用引物序列上TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，(3)多重 PCR 擴增(XP-PCR)以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為多重PCR反應的模板，用上述13對多基因PCR引物等比例混合，每個引物終濃度為2 μ M，再加入通用引物對，終濃度為20 μ Μ，混合均勻為引物預混液，配制25μ L的PCR反應體系，包括10XPCR Buffer2· 5 μ L，IOmM dNTP 2μ L,5M/u L ^ TaqE O. 25 μ L，引物預混液 0. 25 μ L,模板 DNA I μ L,ddH2019y L。將反應物混勻后，放置在PCR儀中，按如下反應循環進行擴增
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權利要求
1. 一種施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒，包括PCR反應試劑，多基因PCR引物和GeXP多重擴增反應試劑，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13對多基因PCR引物和一對通用引物，具體為 為毒力基因sod設計的引物sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGAC TCCACTAACAGA為毒力基因fldA設計的引物fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfIdA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC為毒力基因ompUL設計的引物ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTAompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS設計的引物toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp設計的引物Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA為毒力基因dnaj設計的引物dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA設計的引物mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3設計的引物z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA設計的引物fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH設計的引物pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL設計的引物toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAACtoxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA設計的引物rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTGrpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA設計的引物recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA 含有熒光標記的通用引物對序列，可按常規技術將熒光標記加到通用引物序列上TY-F:5， -AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B:5， -GTACGACTCACTATAGGGA-3，。
2.根據權利要求I所述的施羅氏弧菌(Vibrioshilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒，其特在在于，所述的熒光標記為CY5熒光標記。
3.一種施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA，以其作為模板，用權利要求I所述的13對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產物，利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統對多重PCR反應產物進行檢測分析。
4.如權利要求3所述的施羅氏弧菌(Vibrioshilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測方法，其特征在于，所述的以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為模板，用權利要求I所述的13對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產物是以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為模板，用權利要求I所述的13對多基因PCR引物等比例混合，每個引物終濃度為O. 2 2 μ Μ，再加入通用引物對，終濃 度為1-20 μ Μ，混合均勻為引物預混液，多重PCR反應體系和程序為2(Γ50 μ L的PCR反應體系，包括10XPCR Buffer 2 5 μ L，IOmM dNTP I. 6 4 μ L，5M/μ L 的 TaqE O. 2 O. 5 μ L，引物預混液O. 2 O. 5 μ L，模板DNA O. 8 2 μ L，ddH20 15 37. 5 μ L ;反應程序為-MV 3min ；94°C 30s、59 62°C 50 60s、72。。100s，25 35 個循環；72°C 7min。
全文摘要
本發明公開了一種施羅氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒和檢測方法。它是先提取施羅氏弧菌的基因組DNA，以其作為模板，用13對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產物，利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統對其進行檢測分析。本發明針對已知13個施羅氏弧菌毒力基因設計特異性引物，通過單管反應，一次性快速高效的檢測13種基因而得知檢測出樣品中是否含有攜帶毒力基因、具有潛在致病能力的施羅氏弧菌，其檢測覆蓋面廣，可大大提高施羅氏弧菌檢測的準確性。對珊瑚白化現象的防治提供一定的理論基礎，對進一步保護我國珊瑚島嶼，防止其進一步退化具有重要的現實意義。
文檔編號C12Q1/04GK102899402SQ20121032855
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月6日 優先權日2012年9月6日
發明者陳償, 高磊, 任春華, 胡超群 申請人:中國科學院南海海洋研究所