專利名稱：水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物分子遺傳育種學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
稻痕病是一種世界性的水稻病害，其危害面積與危害程度日趨嚴(yán)重，被稱為水稻的癌癥。利用分子育種技術(shù)選育含有抗稻瘟病基因的品種被認(rèn)為是控制稻瘟病危害最經(jīng)濟(jì)有效的方法。在已公布的抗稻瘟病基因中，水稻品種‘谷梅4號’的Pigm基因是抗譜廣且抗性持久的基因之一，對不同地區(qū)和國家的30多個強致病菌株中的29個表現(xiàn)出高抗或免疫，效果顯著優(yōu)于目前應(yīng)用的廣譜抗瘟基因Pil、Pi2、Ρ 9等，經(jīng)湖南稻瘟病病圃多年鑒定，‘谷梅4號’ 一直為高抗品種。目前含Pigm基因的水稻資源非常少，加大對Pigm基因的利 用將促進(jìn)水稻品種的抗稻瘟病能力。常規(guī)的抗稻瘟病育種方法費時費力，且結(jié)果不太可靠，而利用分子標(biāo)記輔助選擇育種簡單有效，可以降低育種成本，縮短選育周期，亦可進(jìn)行有目的的多基因聚合，提高育種效率，帶來巨大的社會經(jīng)濟(jì)效益。在分子輔助育種中，如果分子標(biāo)記能滿足以下三點則可高效準(zhǔn)確應(yīng)用于分子育種(1)該分子標(biāo)記為共顯性分子標(biāo)記，如SSR，STS等標(biāo)記。因為共顯性分子標(biāo)記可以區(qū)分雜合體和純合體，這在下一步的材料雜交選育中可以提供便利，節(jié)省選育時間；(2)該分子標(biāo)記為共分離標(biāo)記，與目的基因緊密連鎖共分離，因為非緊密連鎖分子標(biāo)記與目的基因有一定距離，在育種中可能因為分離而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確；(3)特異性標(biāo)記，一些非特異性標(biāo)記只能區(qū)分部分親本，如果擴(kuò)大選育親本的范圍，則不能將其用于分子輔助選育，而特異性分子則能用于該基因供體親本與其他不含該基因親本的雜交選育，更適用于產(chǎn)業(yè)化分子育種。Pigm基因被定位于水稻品種‘谷梅4號’第6號染色體C5483和C0428之間70Kb的片段內(nèi)，其基因序列尚無相關(guān)報道，而有關(guān)該基因的分子標(biāo)記或為顯性標(biāo)記或為非緊密連鎖標(biāo)記，如果能建立與抗稻瘟病基因Pigm共分離的特異性分子標(biāo)記，則對促進(jìn)Pigm基因在育種中的應(yīng)用具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子標(biāo)記方法。通過檢測與抗稻瘟病基因Pigm緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以確定水稻親本或雜交后代是否含有高抗稻瘟病基因Pigm，預(yù)測水稻植株的稻瘟病抗性，加快抗稻瘟病水稻新品種的選育進(jìn)度。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟I)提取待測水稻的基因組DNA ；2)用選自下表中的一對或多對引物，對水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
權(quán)利要求
1.水稻抗稻瘟病基因Pigrn的分子標(biāo)記方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取待測水稻的基因組DNA； 2)用選自下表中的一對或多對引物，對水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 分子標(biāo)記I引物名· I引物細(xì)則 G1408F ATAGGCAAGTGCAGGTTG IZG1408 -—-----392G1408R GATGGCTAATACTGAACAAGAA G2997F ATCTC ATCC ACGAAACAT ~ZG2997 ———--679 _ G2997R CAGCGACAACTTGAACTA__ G2723F CCACGCTCATCCATTCCT^ ' G2723R ^^GCcACCTCwrCATCCACTA __mm G530IF CAGTG Λ Λ ACGAACGCTAT. G5301 -^--485 j G5301R ATCTCCACAAGGGACACC 3)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增出對應(yīng)大小的特異性分子標(biāo)記片段，則表明抗稻瘟病基因Pigm的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以25μ I計為=IOXPCR反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ l,25mM MgCl2 2 μ I, IOmM dNTPO. 5 μ 1，25mM 引物 F 和 R 各 O. 5 μ 1，DNA 20ng,Taq DNA 聚合酶 O. 2 μ I，加 ddH20 補足至 25 μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為95°C8分鐘；95°C30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，共35個循環(huán)；72°C 10分鐘。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述方法在水稻抗稻瘟病分子育種中的應(yīng)用。
5.用于檢測水稻抗稻瘟病基因Pigm的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括選自以下引物對中的一對或多對引物i ) G1408F 5' -ATAGGCAAGTGCAGGTTG-3'G1408R 5/ -GATGGCTAATACTGAACAAGAA-3'；ii ) G2997F 5' -ATCTCATCCACGAAACAT-3'G2997R 5/ -CAGCGACAACTTGAACTA-3'；iii) G2723F 5/ -CCACGCTCATCCATTCCT-3' G2723R 5/ -TGCCACCTCATCATCCACTA-3';以及 iν ) G5301F 5' -CAGTGAAACGAACGCTAT-3'G5301R 5/ -ATCTCCACAAGGGACACC-3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子標(biāo)記方法，共篩得4個特異性分子標(biāo)記G1408、G2997、G2723和G5301。利用這4個與抗稻瘟病基因共分離的特異性分子標(biāo)記，對水稻親本或雜交后代的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，凡檢測到含有4個特異分子標(biāo)記中任意一個標(biāo)記的水稻植株則可作為含高抗稻瘟病Pigm基因的育種材料。該方法操作簡便，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足高通量分子標(biāo)記輔助育種的要求。
文檔編號C12Q1/68GK102899400SQ20121032587
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日
發(fā)明者戴小軍, 楊遠(yuǎn)柱, 陳良碧, 胡小淳, 秦鵬, 符辰建 申請人:袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司, 湖南師范大學(xué), 湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院