專利名稱：一種芹菜為原料制作適宜惡疫霉菌產生孢子囊的液體培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物保護領域中ー種植物病原菌惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)產孢子囊的液體培養基。
背景技術：
惡疫霉(Phytophthora cactorum Schroet),屬卵菌門疫霉屬病原菌,是全世界范圍內廣泛分布的重要植物病原菌，能侵染約60個科、50個屬中的約200種植物。惡疫霉菌通常以菌絲體和卵孢子在病殘體和土壌中越冬。翌年條件適宜時菌絲直接侵染寄主，或形成大量游動孢子囊傳播到地上部侵染莖葉。孢子囊在該病的傳播和蔓延中起著非常重要的作用。通常，在室內進行致病力測定或其它相關生物學特性研究時均需要制備孢子囊懸浮 液。目前，誘導惡疫霉產生孢子囊的方法主要采用菌絲水培法，主要方式有(I)將培養好的菌絲體置于裝有消毒土壌浸出液或滅菌蒸餾水的皮氏培養液中，再將培養皿置于熒光燈下照射3天，每天振蕩皿液3次，第三次補充液體，并在8°C下培養2小時使游動孢子釋放。(2)從菌落邊緣切取菌絲塊放入15ml 10% V6培養液的培養皿中，置于25°C、黑暗中培養3d，然后將菌絲挑入倒有15ml滅菌蒸餾水的培養皿內，置于25°C下光照3d，每天換水I次。孢子囊產生后將盛有大量孢子囊的培養皿放入4°C冰箱中15min后，移至25°C下靜置20min，誘使大量游動孢子產生。各種水培法在實施過程中所用試驗材料繁多，試驗步驟較多，操作復雜，且在有些供試液體培養基中產生的孢子囊不容易釋放出游動孢子，影響下ー步試驗的開展。因此，迫切需要一種篩選出ー種原料簡單、操作簡便的培養基，使惡疫霉能在該液體培養基中產生大量孢子囊且易釋放出游動孢子用于相關研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種使惡疫霉菌產生孢子囊的液體培養基。本發明克服了目前利用惡疫霉菌菌絲水培法誘導產生孢子囊原料繁多、操作復雜的缺點，提供了一種簡便易行的在液體培養基中培養產生孢子囊的方法。本發明的技術方案是利用；^:菜(Apium graveolens)為原料制作液體培養基用于
惡疫霉產生孢子囊。以芹菜為原料制作適宜惡疫霉菌產生孢子囊的液體培養基，具體制作方法為，芹菜去葉洗浄切碎后按w/ν為I : I的比例加入去離子水于榨汁機中榨汁，將所得芹菜汁用四層紗布過濾后用含0.02% (w/v)CaCO3去離子水稀釋至含芹菜汁10% 50% (v/v)，分裝后以0. 103MPa、121°C、高壓蒸氣滅菌20min ;將滅菌液體培養基倒入滅菌的9cm直徑培養皿中，每皿倒15ml。培養液冷卻后用直徑5mm的打孔器在已培養3d的菌落邊緣打取菌塊接種于液體培養基中，每皿放入5個菌絲塊。將接種后的培養皿置于25°C下黑暗培養5d后，將液體培養基倒棹，用無菌水繼續培養2d后，更換一次無菌水，再培養3d后便產生大量孢子嚢。隨后將培養皿置于4°C冰箱中處理30-60min，再置于25°C下培養l_2h，孢子囊開始大量釋放出游動孢子。本發明的有益效果是利用芹菜ー種原料制作的液體培養基就能產生大量孢子囊，克服了以往采用2種或多種蔬菜不同比例混合才能獲取大量孢子囊的繁雜操作。另外，該培養基原材料成本低廉且容易獲取，培養基的制作和孢子囊產生的程序簡單易學，且這種方法可以用于孢子囊形態的鑒定、惡疫霉菌致病力測定中游動孢子懸浮液的制備等相關的研究，具有較高的實際應用價值。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例芹菜液體培養基與其它液體培養基產孢子囊能力及游動孢子釋放能力差異比較
I、液體培養基制作(I)黃瓜培養基(10% ):黃瓜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : 9比例混勻。(2)黃瓜培養基(50% ):黃瓜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : I比例混勻。(3)番茄培養基(10% ):番茄洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : 9比例混勻。(4)番茄培養基(50% ):番茄洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : I比例混勻。(5)芹菜培養基(10% ):芹菜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : 9比例混勻。(6)芹菜培養基(25% ):芹菜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : 3比例混勻。(7)芹菜培養基(50% ):芹菜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : I比例混勻。(8)番茄黃瓜培養基(10% ):將番茄和黃瓜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾，按番茄與黃瓜體積比I : 2的比例混合，再將混合液用含O. 02% CaOT3去離子水稀釋至10%。(9)番茄黃瓜培養基(50% ):將番茄和黃瓜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾，按番茄與黃瓜體積比I : 2的比例混合，再將混合液用含O. 02% CaOT3去離子水稀釋至50%。(10)番茄芹菜培養基(10% ):將番茄和芹菜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾，按番茄與芹菜體積比I : 2的比例混合，再將混合液用含O. 02%CaCO3去離子水稀釋至10%。(11)番茄芹菜培養基(50% ):將番茄和芹菜洗凈切碎后于榨汁機中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾，按番茄與芹菜體積比I : 2的比例混合，再將混合液用含O. 02%CaCO3去尚子水稀釋至50%。將上述培養基分別分裝后于O. 103MPa, 121 °C，高壓蒸氣滅菌20min。冷卻至40°C左右制作液體培養基。2、不同培養基產孢能力差異測定用直徑5mm的打孔器在已培養3d的菌落邊緣打取菌塊，置于上述11種不同液體培養基中，每皿放入5個菌絲塊。將接種后的培養皿置于25°C下黑暗培養5d，將液體培養基倒棹，用無菌水繼續培養2d后，更換一次無菌水，再培養3d后調查液體培養基中孢子囊產生量。每個培養基重復3次。每次調查從培養皿中用五點法取五塊Icm2大小的菌絲塊，顯微鏡10倍目鏡下計數每個視野菌絲塊上產生的孢子囊數量，統計分析不同液體培養基產生孢子囊能力的差異。待不同液體培養基中惡疫霉菌大量產生孢子囊后，將培養皿置于4°C冰箱中30-60min，再取出置于25°C下培養，觀察計數不同液體培養基中游動孢子釋放的比例，統計分析不同液體培養基中游動孢子釋放能力的差異。
惡疫霉菌在芹菜液體培養基中培養產生孢子囊及游動孢子釋放的能力明顯高于其它供試培養基(表I)。另外，芹菜液體培養基中芹菜汁的濃度不同對產孢量和游動孢子釋放量也有影響，芹菜培養基(10% ) >芹菜培養基(25% ) >芹菜培養基(50% )。表I芹菜培養基與其他培養基產孢子囊能力差異比較
供試培養基単位面積產生孢子囊的量(個/視野)I游動孢子釋放比例(％)
黃瓜培養基(10% )17 + 7F5276
黃瓜培養基(50%)83±2D12.8'
番茄培養基(10%)88±4D57. 5
番茄培養基(50%)113±19C8.3
芹菜培養基(10%)214±10A92. 3'
芹菜培養基(25%)196±7AB87.9'
芹菜培養基(50% )174 + 5B8^4
番茄黃瓜培養基(10% ) 111 + 7C6ΤΓ8
番茄黃瓜培養基(50% ) 11±3F26. 7
番茄芹菜培養基(10% ) 17 + 2F7 Τ6
番茄芹菜培養基(50% ) 44 + 4EΙΓδ
:0028]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.ー種以芹菜為原料制作適宜惡疫霉菌產生孢子囊的液體培養基，其特征在于，具體制作方法為，芹菜去葉洗凈切碎后按w/v為I : I的比例加入去離子水于榨汁機中榨汁，將所得汁液用四層紗布過濾后用含O. 2% (w/v) CaCO3的去離子水稀釋至含芹菜汁10% 50% (v/v)，分裝后以O. 103MPa、121°C、高壓蒸氣滅菌20min ;將滅菌培養基倒入滅菌的培養皿中制成液體培養基。
全文摘要
本發明公開了一種以芹菜為原料制作適宜惡疫霉菌產生孢子囊的液體培養基，具體制作方法為，芹菜去葉洗凈切碎后按w//v為1∶1的比例加入去離子水于榨汁機中榨汁，將所得芹菜汁用四層紗布過濾后用含0.02％(w/v)CaCO3的去離子水稀釋至含芹菜汁10％～50％(v/v)，分裝后以0.103MPa、121℃、高壓蒸氣滅菌20min；將滅菌液體培養基倒入滅菌的9cm直徑培養皿中，每皿倒15ml。該培養基原材料成本低廉且容易獲取，培養基的制作和孢子囊產生的程序簡單易學，大大提高了惡疫霉菌孢子囊產生的效率，為病原菌接種體的制備提供了極大的便利。
文檔編號C12R1/645GK102839148SQ201210323198
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者楊敏, 朱書生, 朱貴李, 梅馨月, 何霞紅, 李成云, 朱有勇 申請人:云南農業大學