前列腺癌分子標志物miR-99a及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明為前列腺癌的診斷提供了一種新的分子標志物miR-99a，并將該分子標志物應用于制備診斷前列腺癌的診斷試劑盒中，miR-99a在前列腺癌患者血清中的含量比在正常人血清中的含量升高，而在患者接受手術后，其血清中的miR-99a含量回落到正常水平，本發明還提供了一種診斷前列腺癌的診斷試劑盒。使用該分子標志物及含有該分子標志物的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡單、取材方便、安全無創傷，且具有高特異性、高靈敏性和易于大量篩查的特點，該分子標志物特別適合應用于前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑒定、前列腺癌治療狀況的監測、前列腺癌指導用藥的監測、和前列腺癌預后監測等領域用試劑中。
【專利說明】前列腺癌分子標志物mi R-99a及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種前列腺癌分子標志物miR-99a及其在制備診斷前列腺癌試劑中的應用，尤其涉及前列腺癌分子標志物miR_99a在前列腺癌聞危人群的篩選、前列腺癌的鑒定、前列腺癌治療狀況的監測、前列腺癌指導用藥的監測、和前列腺癌預后監測等領域用試劑中的應用。
【背景技術】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈微小RNA分子，其在細胞內具有多種重要的調節作用。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某個基因的表達。據推測，miRNA調節著人類三分之一的基因。MicroRNA因其高度的保守性、時空特異性、穩定性以及組織特異性等特點使其優于蛋白質、DNA片段等其他生物標志物而在疾病發病機制研究、早期診斷、個體化治療和預后等方面發揮越來越重要的作用。
[0003]前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲以后發病，95%發生于60歲以上的老年男性，發生率持續地隨年齡增長而增加。在美國，前列腺癌的發病率已經超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤。中國等亞洲前列腺癌的發病率遠遠低于歐美國家，但近年來呈現上升趨勢。前列腺癌早期多無任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視。當腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增生相混淆。在我國約80%的病人首先發現遠處轉移病灶，然后才發現前列腺癌。此時，病變已屬晚期，預后不良。
[0004]目前，前列腺癌的臨床診斷方式主要有以下幾種:直腸指檢、血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。直腸指檢是最簡單、最經濟實用的方法，主要是通過醫生的食指觸摸前列腺，用以發現很多無癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根治的機會。但上述方法均存在一定的局限性。如直腸指檢的局限性是:(1)當患者的前列腺腫塊不大時，容易漏診`；(2)有的患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬晚期，不易根治；(3)對患者有一定的不適和危害，當患者直腸有疾患時不能使用此檢測；(4)當醫生經驗不足時有漏診或誤診可能。正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，當處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病狀態時PSA升高，成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標，但其也存在一定局限性:(1)需要取血檢測，對患者有一定的損傷；(2)PSA增高也常見于非前列腺癌疾病，如前列腺炎癥、前列腺肥大等，因此不易確診；(3) PSA增高確診前列腺癌時，往往患者已屬中、后期，達不到早期診斷的目的。前列腺超聲波檢測操作簡便直觀、無損傷，通過顯示腫塊的大小、數目、位置、密度、邊緣、形態、有無鈣化以及鈣化的形態、大小、數目、分步以及周圍的暈環、皮膚改變等提供定位及定性征象并判斷病變的性質:其局限性是:(1)對致密性的小癌灶容易漏診；(2)有時不能提供明確的定性診斷；(3)因其不能顯示腫瘤的內部結構及周圍組織所以診斷符合率很低；(4)對一些缺乏典型征象的實性良惡性腫塊有較高的誤診率。活組織病理檢查因其創傷性、復雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標準，一般與其他方法技術連用。
[0005]近年來的研究表明，前列腺癌和miRNA密切相關，它們可能參與腫瘤的發生、發展和轉移，所以對腫瘤的發病機制、早期診斷、個體化治療、轉移的檢測和預后等可能有相應的作用。與前列腺癌相關的miRNA種類較多且作用不一，已有研究表明在前列腺癌患者中上調的 miRNA 包括 miR-375，miR_148a，miR-200c, miR-106a, mir-128, miR-218, miR_20a，和 miR-30b 等；下調的 miRNA 包括 miR-143, miR-145, miR-199a_5p，miR-223, miR_27a，miR-152和miR-424等。雖然已在該領域進行了一些研究，但現有的miRNA標志物的準確性、靈敏性方面均有不足，在臨床和研究中仍然存在尋找更加準確和靈敏的前列腺癌miRNA標志物的需求。
【發明內容】
[0006]為了克服上述現有技術中存在的不足，本發明提供了一種與前列腺癌相關的新的前列腺癌分子標志物， 并提供了該分子標志物在制備診斷前列腺癌試劑中的應用。
[0007]該前列腺癌的分子標志物為miR_99a,其核苷酸序列為5’ -AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG -3’ (SEQ ID NO:1)。在研究過程中發明人發現，miR_99a 在前列腺癌患者血清中的含量比正常人血清中的含量高，而當前列腺癌患者在接收手術后，其血清中的miR-99a的含量就回落到與正常人血清中的含量一樣的正常水平。由此可見，患者在患病期間增加的miR-99a與前列腺癌的腫瘤存在著密切的相關性。在上述發現的基礎上，本發明提供了一種前列腺癌分子標志物，以及該分子標志物在制備診斷前列腺癌試劑中的應用。
[0008]本發明為了解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0009]—種前列腺癌分子標志物miR_99a,其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所不的序列，為5，- AACCCGUAGAUCCGAUCUUG UG -3'
[0010]所述的前列腺癌分子標志物miR-99a在制備診斷前列腺癌試劑中的應用在于，所述診斷前列腺癌試劑通過檢測被試者血清中miR-99a的含量，并將該miR_99a含量與正常水平miR-99a含量相比較來診斷前列腺癌。
[0011]所述被試者血清中miR-99a的含量通過定量PCR方法進行檢測。
[0012]所述前列腺癌分子標志物miR_99a用于制備診斷前列腺癌的診斷試劑盒。
[0013]所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒包括:
[0014](I)血清總RNA提取試劑，
[0015](2) RNA 加 polyA 試劑，
[0016](3) RT-PCR 試劑，
[0017](4)定量 PCR 試劑；
[0018]其中所述定量PCR試劑中包括所述前列腺癌分子標志物miR_99a的特異性正向引物(即GSP外源對照-3)，該特異性正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.7所示的序列，為5， - UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3，。
[0019]所述診斷試劑盒中血清總RNA提取試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.2的外源對照-1，為 5’ - CAACCTCCTAGAAA GA -3’。
[0020]所述診斷試劑盒中RNA加polyA試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.3的外源對照-2，為 5’ - TGAGCAACGCGAACA A-3’。
[0021 ] 所述診斷試劑盒中RT-PCR試劑中包括序列為SEQ ID N0.4的RT-引物，為5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，其中 V 為 A、C 和 G 中的任一種，N為A、T、C和G中的任一種。
[0022]所述診斷試劑盒中定量PCR試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.5的通用反向引物UPM-短片段，為5’ - CTCACAC GACTCACGACAC-3’ ；和核苷酸序列為SEQ ID N0.6的通用反向引物 UPM-長片段，為 5’ -CTCACACGACTCACGACACC AGTGGTATCAACGCACTC-3’。
[0023]本發明的有益技術效果是:本發明為前列腺癌的診斷提供了一種新的分子標志物miR-99a,并將該分子標志物應用于制備診斷前列腺癌的診斷試劑盒中，使用該分子標志物及含有該分子標志物的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡單、取材方便、安全無創傷，且具有高特異性、高靈敏性和易于大量篩查的特點，該分子標志物特別適合應用于前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑒定、前列腺癌治療狀況的監測、前列腺癌指導用藥的監測、和前列腺癌預后監測等領域用試劑中。
【具體實施方式】
[0024]為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例進一步闡述本發明，但下述實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍 ，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。
[0025]1.血清或血漿中總RNA的提取:
[0026]抽取3名前列腺患者手術前7天及手術后7天的血液各2毫升，同時抽取同期3名正常人血液各2毫升作為對照。將上述血液凝血后進行離心，最后取上層血清I毫升置于1.5毫升的無DNA和RNA污染的離心管中。
[0027]使用康維世紀公司生產的RNA提取試劑盒自上述血清中提取總RNA，每250微升血清中加入I微升外源對照-1 (北京曠博生技術有限公司提供)來監控上述血清中RNA的提取質量。提取的總RNA通過使用Therm NanoDrop 2000c儀器，測定260/280nm紫外波長的比值進行的濃度測定。所述外源對照-1的序列為5’-CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ IDNO:2)。
[0028]2.定量檢測血清中的microRNA:
[0029]I)加 poly (A)尾:
[0030]在無RNA酶的PCR管(VWR公司生產，200微升)中配制加A尾的反應液，體系總量為20微升。每20微升體系反應液中加入I微升特異的外源對照_2(北京曠博生技術有限公司提供)來監控miRNA的加尾及反轉錄質量,所述反應液體系如表1所示。將裝有配制好反應液的PCR管放入PCR儀(Thermo)中，在37°C下孵育I小時，得到孵育反應液I。所述外源對照-2 的序列為 5’ - TGAGCAACGCGAACAA -3’(SEQ ID NO:3)。
[0031]表1
[0032]
組分
加入量(微升)
外源對照-2 (20nm)I
【權利要求】
1.一種前列腺癌分子標志物miR-99a,其特征在于:所述前列腺癌分子標志物miR_99a的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示的序列。
2.根據權利要求1所述的前列腺癌分子標志物miR-99a在制備診斷前列腺癌試劑中的應用。
3.根據權利要求2所述的前列腺癌分子標志物miR-99a在制備診斷前列腺癌試劑中的應用，其特征在于:所述診斷前列腺癌試劑通過檢測被試者血清中miR-99a的含量，并將該miR-99a含量與正常水平miR_99a含量相比較來診斷前列腺癌。
4.根據權利要求3所述的前列腺癌分子標志物miR-99a在制備診斷前列腺癌試劑中的應用，其特征在于:所述被試者血清中miR-99a的含量通過定量PCR方法進行檢測。
5.根據權利要求2所述的前列腺癌分子標志物miR-99a在制備診斷前列腺癌試劑中的應用，其特征在于:所述前列腺癌分子標志物miR-99a用于制備診斷前列腺癌的診斷試劑盒。
6.一種權利要求5所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒包括: (1)血清總RNA提取試劑，
(2)RNA 加 polyA 試劑，
(3)RT-PCR 試劑， (4)定量PCR試劑； 其中所述定量PCR試劑中包括所述前列腺癌分子標志物miR-99a的特異性正向引物，該特異性正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.7所示的序列。
7.根據權利要求6所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒中血清總RNA提取試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.2的外源對照-1。
8.根據權利要求6所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒中RNA加polyA試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.3的外源對照_2。
9.根據權利要求6所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒中RT-PCR試劑中包括序列為SEQ ID N0.4的RT-引物。
10.根據權利要求6所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒中定量PCR試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.5的通用反向引物UPM-短片段，和核苷酸序列為SEQ ID N0.6的通用反向引物UPM-長片段。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667280SQ201210314242
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年8月30日 優先權日:2012年8月30日
【發明者】范盤生, 夏東元, 蒲金賢 申請人:蘇州博泰安生物科技有限公司