一種檢測cho培養細胞中支原體污染的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測CHO培養細胞中支原體污染的試劑盒及其檢測方法，屬于生物技術檢測領域。該試劑盒包括置于同一PCR體系中的特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對與特異性擴增支原體16srRNA保守區域DNA序列的引物對。在PCR檢測支原體污染的同時，可同時完成檢測結果可靠性的判定。該發明大大提高了CHO培養細胞中支原體污染檢測結果的可靠性，且操作簡單，檢驗周期短，具有良好的樣品檢測的操作性。
【專利說明】一種檢測CHO培養細胞中支原體污染的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物技術檢測領域中進行支原體檢測的試劑盒及其檢測方法，具體涉及一種利用PCR技術快速準確鑒定CHO培養細胞中支原體污染的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]自從1956年Robinson LB等首次報道細胞培養中的支原體污染以來，國內外關于支原體污染細胞和疫苗等生物制品的報道屢見不鮮。支原體是微生物中最簡單和最小的生命形式，它是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5 μ m之間。支原體由于體積較小，可以穿過CHO細胞培養時用于過濾微生物的常規濾器；而且支原體感染后只產生少量可見的混濁和細胞傷害，導致支原體的感染在幾次傳代甚至幾個月的時間內都不易被覺察；加上支原體對于細胞培養中常規應用的抗生素具有良好的耐受性，使得支原體感染成為細胞培養中普遍存在的、隱蔽的、惡性的污染源。支原體對宿主的生理生長影響嚴重，CHO細胞一旦受支原體感染后，便出現生理水平遠遠偏離正常的情況，而CHO細胞又是重組蛋白質藥物生產的首要體系，因此對CHO細胞培養體系中支原體污染的快速準確檢測顯得尤為重要。
[0003]PCR檢測方法應用特異性引物擴增支原體基因組序列，具有靈敏、準確的特點，并且檢測周期短，4個小時即可以看到檢驗結果，被越來越廣泛的用于檢測CHO細胞中的支原體污染，2006年歐洲藥典已將PCR作為常規檢測方法。盡管PCR檢測方法具有如此多的優點，但也有不足之處。由于PCR實驗設計、實驗操作、實驗試劑等方面的問題，容易造成PCR檢測結果出現假陽性和假陰性。出現假陽性主要由于多重擴增所致，而出現假陰性的主要原因是反應體系尤其是樣品中 存在的物質阻礙了反應的進行，例如蛋白質、高鹽或PH條件的不適宜導致反應的終止。由此帶來的誤判、錯判會給實際生產帶來巨大的經濟損失，因此需要進一步增強PCR支原體污染檢測方法的可靠性及準確性。一般的支原體污染的PCR檢測方法中多以去核酸水為陰性對照模板，陽性對照模板為支原體基因組DNA，以此來判定檢測結果。如下表所示。
【權利要求】
1.一種檢測CHO培養細胞中支原體污染的試劑盒，它包括置于同一 PCR體系中的特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對與特異性擴增支原體16s rRNA保守區域DNA序列的引物對。
2.如權利要求1所述的試劑盒，所述特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對為:
上游引物 GF:5’ - CAAAGGCACAGTCAAGGCTGA -3’ ；
下游引物 GR:5’ - TGGTGAAGACGCCAGTAGATT -3’。
3.如權利要求1所述的試劑盒，所述特異性擴增支原體16srRNA保守區域DNA序列的引物對為:
上游引物 MF:5’ - ACACCATGGGAGCTGGTAAT -3’ ；
下游引物 MR:5’ - GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT -3’。
4.如權利要求3所述的試劑盒，所述特異性擴增支原體16srRNA保守區域DNA序列的引物對的擴增產物長度為400~500 bp。
5.如權利要求1所述的的試劑盒， 所述PCR體系中特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對與特異性擴增支原體16s rRNA保守區域DNA序列的引物對的濃度比為1:2。
6.如權利要求1所述的試劑盒，所述PCR體系中含有PCR反應緩沖液、dNTPs溶液、rTaq聚合酶和超純水。
7.利用權利要求1~6任一項所述試劑盒檢測CHO培養細胞中支原體污染的方法，包括如下步驟: 1)提取待檢CHO培養細胞的DNA； 2)以步驟I)中提取的DNA為模板加入PCR體系，進行擴增反應； 3)以去核酸水為模板加入PCR體系，進行擴增反應，作為陰性對照； 4)所有擴增反應結束后，同時進行瓊脂糖凝膠電泳； 5)觀察瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，判定檢測結果的方法如下所述: A)當特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對相應的擴增產物出現，陰性對照沒有出現擴增產物時，說明PCR體系正常工作，此時的PCR檢測結果準確可罪； A-1 )此時，如果沒有出現特異性擴增支原體16s rRNA保守區域DNA序列的引物對相應的擴增產物，說明CHO培養細胞中沒有出現支原體污染； A-1I )此時，如果出現了特異性擴增支原體16s rRNA保守區域DNA序列的引物對相應的擴增產物，說明CHO培養細胞中出現了支原體污染； B)如果特異性擴增CHO細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA序列的引物對相應的擴增產物沒有出現，說明PCR體系沒有正常工作，此時檢測結果無效； C)如果陰性對照出現擴增產物，說明PCR體系受到污染，此時檢測結果無效。
8.如權利要求7所述的檢測方法，步驟I)中所述提取待檢CHO培養細胞DNA的方法為:取待檢CHO培養細胞液離心沉淀；用PBS緩沖液充分懸浮沉淀物，離心沉淀；棄上清，加入TE緩沖液，再次充分懸浮沉淀物，煮沸；離心沉淀，取上清作為PCR反應模板。
9.如權利要求7所述的檢測方法，步驟2)與步驟3)所述擴增反應的反應條件為:94°C預變性5分鐘，然后94°C變性30秒，50°C~53°C退火30秒，72°C延伸40秒，35個循環后，72 °C恒溫10分鐘。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627781SQ201210303846
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月24日 優先權日:2012年8月24日
【發明者】劉曉志, 周興軍, 董向峰, 常亮, 陳雪靜, 劉素霞, 趙偉, 高健, 段寶玲 申請人:華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司