一種重組Mut^s型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法

專利名稱：一種重組Mut^s型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，屬于微生物技術領域。
背景技術：
脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應。除此之外還表現出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等，具有高度的化學選擇性和立體異構性。脂肪酶不同活性的發揮依賴于反應體系的特點，如在油水界面促進酯水解，而在有機相中可以酶促合成和酯交換，廣泛應用于食品、輕紡、皮革、香料、化妝品、洗滌劑、有機 合成、醫藥等領域。脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中，但以微生物種類最多，目前發現的微生物中有近60個種屬產脂肪酶，工業化生產的就有近20種。微生物脂肪酶按其晶體結構可分為根毛霉脂肪酶家族、褶皺假絲酵母脂肪酶家族、洋蔥假單胞菌脂肪酶家族、葡萄球菌脂肪酶家族以及黑曲霉脂肪酶、熒光假單胞菌脂肪酶、莓實假單胞菌脂肪酶、南極假絲酵母脂肪酶等。微生物種類多、繁殖快、易發生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用pH、作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業化大生產和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業用脂肪酶的重要來源，而且在理論研究方面也具有重要的意義。我國在20世紀60年代就開展了微生物脂肪酶的研究，工業化生產解脂假絲酵母脂肪酶已有40多年的歷史，但是自然菌株產酶量低，難以滿足工業生產的需要，而脂肪酶基因在重組甲醇營養型畢赤酵母中的表達取得了較大成功，使得人們把注意力集中到脂肪酶的克隆和基因表達調控上。甲醇營養型畢赤酵母作為真核表達系統的宿主菌不僅具有真核表達系統所特有的特點，而且營養要求低、生長快、培養基廉價，使得其在學術和工業上的應用越來越廣泛。甲醇營養型畢赤酵母含有兩個醇氧化酶編碼基因一AOXl和A0X2，當菌株同時含有AOXl和A0X2基因，菌株表型為Mut+型，當菌株缺失AOXl基因，會喪失大部分的醇氧化酶活性，產生表型為Muts型的菌株。Mut+型菌株甲醇代謝能力強，多數情況下外源蛋白的表達量比Muts型菌株高，所以一直以來重組甲醇營養型畢赤酵母多采用Mut+型菌株，但是該型菌株發酵時，甲醇消耗大、溶氧要求高，進而導致電能、冷卻水等能耗消耗大，不僅成本高，設備要求高，而且也不易于控制。同時甲醇易揮發易燃，大量存放存在潛在危險。

發明內容
本發明的目的是提供一種重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，以減少甲醇用量，降低能耗，從而節省工業成本。為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是一種重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，具體步驟如下
I)重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母GSl 15接種于種子培養基中培養，再接種于發酵培養基BSM中培養；2)通氣攪拌發酵，發酵過程中溶氧控制在20-40%，加入氨水調節pH5-6 ；3)發酵培養基甘油耗盡，補加補料培養液，維持溶氧20-35% ；4)細胞濕重達到350g/L以上，停止補加補料培養液；5)待甘油耗盡，流加誘導培養液，流加量為l_3ml/L. h，控制培養溫度為22_26°C，氨水調節PH6，誘導培養；6) 6000rpm離心IOmin,得到含有脂肪酶的上清液。所述的補料生長液為含UmVLPTM1的50%甘油。
所述的誘導培養液為含12ml/L PTM1的100%甲醇。本發明通過采用缺失了 AOXl基因的重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶，該菌株對甲醇的消耗和溶氧的需求較小，能夠減輕動力負荷，能耗少，節省原材料成本，便于控制。依據國家標準GBT23535-2009，對本發明生產的脂肪酶進行酶活測定，脂肪酶酶活可達9000U/ml，部分生產工藝條件下，脂肪酶產量甚至可以提高到10000U/ml，所以更利于脂肪酶的工業化生產。
具體實施例方式重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母購自鄭州大學化工與能源學院應用化學研究所。培養基及培養液的制備I)種子培養基酵母粉10g/ml,蛋白胨 20g/ml,甘油 10g/ml, IOOmM pH6. O 磷酸鹽緩沖液 100ml/L。2)發酵培養基BSM85%H3P0426. 7ml/L, CaSO4O. 93g/L, K2S0418. 2g/L, MgSO4 · 7H2014. 9g/L, K0H4. 13g/L,甘油 40g/L，PTM1I OOml/L, 25% 氨水調節 pH5_6。3) PTM1CuSO4 · 5H206g/L, NaIO. 08g/L, MnSO4 · H203g/L, Na2MoO4 · 2H200. 2g/L, H3BO3O. 02g/L, CoCl2O. 5g/L, ZnCl220g/L, FeSO4 · 7H2065g/L, H2S045ml/L,生物素 0. 2g/L。4)補料生長液含UmVLPTM1 的 50% 甘油。5)誘導培養液含12ml/L PTM1 的 100% 甲醇。實施例I本實施例重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養基中，280C 200rpm培養20h，再接種于滅菌的發酵培養基BSM中，接種量為5% ；2)通氣攪拌發酵，發酵過程中溶氧控制在40%，自動流加25%工業氨水調節pH6，溫度控制在28 °C ；3)待發酵培養基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續維持溶氧在35% ；4)待細胞濕重達到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態；
5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養溫度為22°C，流加量l-6h為lml/L. h，6h后增加至2ml/L. h，25%工業氨水調節pH6，誘導培養80h ；6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據國家標準GBT23535-2009，測定本實施例生產的脂肪酶酶活。測試結果為80h發酵上清中脂肪酶酶活為9000U/ml。實施例2本實施例重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養基中，280C 200rpm培養20h，再接種于滅菌的發酵培養基BSM中，接種量為10% ；2)通氣攪拌發酵，發酵過程中溶氧控制在30%，自動流加25%工業氨水調節pH5，溫度控制在28 °C ； 3)待發酵培養基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續維持溶氧在30% ；4)待細胞濕重達到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態；5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養溫度為26°C，流加量l-6h為lml/L. h，6h后增加至2ml/L. h，25%工業氨水調節pH6，誘導培養80h ；6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據國家標準GBT23535-2009，測定本實施例生產的脂肪酶酶活。測試結果為80h發酵上清中脂肪酶酶活為9700U/ml。實施例3本實施例重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養基中，280C 200rpm培養20h，再接種于滅菌的發酵培養基BSM中，接種量為8% ；2)通氣攪拌發酵，發酵過程中溶氧控制在20%，自動流加25%工業氨水調節pH6，溫度控制在28 °C ；3)待發酵培養基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續維持溶氧在20% ；4)待細胞濕重達到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態；5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養溫度為24°C，流加量l-6h為lml/L. h，6h后增加至2ml/L. h，25%工業氨水調節pH6，誘導培養80h ；6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據國家標準GBT23535-2009，測定本實施例生產的脂肪酶酶活。測試結果為80h發酵上清中脂肪酶酶活為9300U/ml。實施例4本實施例重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養基中，280C 200rpm培養20h，再接種于滅菌的發酵培養基BSM中，接種量為10% ；2)通氣攪拌發酵，發酵過程中溶氧控制在30%，自動流加25%工業氨水控制pH5，溫度控制在28 °C ；3)待發酵培養基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續維持溶氧在30% ；4)待細胞濕重達到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態；5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養溫度為26°C，流加量l-6h為lml/L. h，6h后增加至2ml/L. h，30h后甲醇流加速度增加至3ml/L. h，25%工業氨水調節pH6，誘導培養80h ；
6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據國家標準GBT23535-2009，測定本實施例生產的脂肪酶酶活。測試結果為80h發酵上清中脂肪酶酶活為9500U/ml。實施例5本實施例重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，具體步驟如下I)挑取重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母GS115單菌落接種于種子培養基中，280C 200rpm培養20h，再接種于滅菌的發酵培養基BSM中，接種量為10% ；2)通氣攪拌發酵，發酵過程中溶氧控制在30%，自動流加25%工業氨水控制pH5，溫度控制在28 °C ；3)待發酵培養基甘油耗盡，補加含12ml/L PTM1的50%甘油，繼續維持溶氧在30% ；4)待細胞濕重達到350g/L以上，停止補加甘油，維持饑餓狀態；
5)待甘油耗盡，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培養溫度為26°C，流加量
l-6h為lml/L. h, 6h后增加至2ml/L. h, 30h后甲醇流加速度增加至3ml/L. h, 50h后甲醇流加速度降低至2ml/L. h，25%工業氨水調節pH6，誘導培養80h ；6)6000rpm離心lOmin，得到含有脂肪酶的上清液。依據國家標準GBT23535-2009，測定本實施例生產的脂肪酶酶活。測試結果為80h發酵上清中脂肪酶酶活為10700U/ml。
權利要求
1.一種重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，其特征在于，具體步驟如下 1)重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母GS115接種于種子培養基中培養，再接種于發酵培養基BSM中； 2)通氣攪拌發酵，發酵過程中溶氧控制在20-40%，加入氨水調節pH5-6； 3)發酵培養基甘油耗盡，補加補料培養液，維持溶氧20-35%； 4)細胞濕重達到350g/L以上，停止補加補料培養液； 5)待甘油耗盡，流加誘導培養液，流加量為l_3ml/L.h，控制培養溫度為22-26°C，氨水調節pH6，誘導培養； 6)6000rpm離心IOmin,得到含有脂肪酶的上清液。
2.根據權利要求I所述的一種重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，其特征在于，所述的補料生長液為含UmVLPTM1的50%甘油。
3.根據權利要求I所述的一種重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，其特征在于，所述的誘導培養液為含UmVLPTM1的100%甲醇。
全文摘要
本發明公開了一種重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶的方法，具體步驟如下重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母GS115接種于種子培養基培養，再接種于發酵培養基BSM中發酵；待發酵培養基甘油耗盡，補加補料培養液；當細胞濕重達到350g/L以上，停止補加補料培養液；待甘油耗盡，流加誘導培養液，流加量為1-3ml/L.h，控制培養溫度為22-26℃，誘導培養；離心，得到含有脂肪酶的上清液。本發明通過采用缺失了AOX1基因的重組Muts型甲醇營養型畢赤酵母生產脂肪酶，該菌株對甲醇的消耗和溶氧的需求較小，能夠減輕動力負荷，能耗少，節省原材料成本，便于控制，利于工業生產。
文檔編號C12R1/84GK102776163SQ20121030201
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月22日 優先權日2012年8月22日
發明者司富強, 蔡翔 申請人:鄭州慧澤生化科技有限公司