專利名稱：牟氏角毛藻培養基配方及白塑料桶充氣培養方法
技術領域：
本發明屬于海洋微藻養殖領域，尤其涉及一種牟氏角毛藻培養基配方及白塑料桶充氣培養方法。
背景技術：
牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)隸屬娃藻門，中心綱，盒形藻目，角毛藻科，角毛藻屬，是一種小型海洋浮游硅藻，細胞小，壁薄，多數單個生活，在10 39°C環境溫度下均能生長繁殖，最適溫度25 30°C，是一種沿岸性半咸水種類。與其它常用單胞藻如球等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)、湛江叉鞭金藻(Dicrszhan jiangensis)和扁
藻(Platymonas)相比,牟氏角毛藻藻含有大量脂肪酸、蛋白質等營養物質,繁殖快且耐高溫。多不飽和脂肪酸含量高，在良好培養條件下，其二十碳五烯酸(EPA)占總脂肪酸含量10.2%，是對蝦、海參、文蛤、牡蠣、鮑魚、魁鉗、海膽等海珍品優質育苗餌料，在醫藥、保健品行業也有重要應用價值。海水中無機碳的存在形式以HC03_為主(90% )，而游離的CO2不足I %。過去人們一直認為，水體中游離CO2是藻類利用外源無機碳的唯一形式。張學成的工作表明，螺旋藻培養基中添加50 100mmol/L NaHCO3時，不僅可以滿足螺旋藻生長的需要，而且有助于保持藻體生長的PH值。林惠民認為，NaHCO3在培養基中的作用之一是作為碳源。我的研究結果表明，牟氏角毛藻可以利用HC03_作為碳源。另外，氮磷營養鹽對牟氏角毛藻的生長影響極顯著，氮的影響高于磷。傳統上人們習慣利用硝酸鈉或硝酸鉀作為培養牟氏角毛藻氮源，但我的實驗顯示，用尿素作氮源牟氏角毛藻生長更快，產量更高。尿素對不同微藻生長影響機理較無機氮復雜。已經證實許多藻含有尿素酶，在酶的催化下，尿素分解出氨被微藻利用。可能是酶功能的差異造成了各種微藻利用氮或磷的能力差異。目前牟氏角毛藻生產上多采用m培養基配方進行培養。牟氏角毛藻規模化培養存在的主要問題是營養物質不均衡，不全面，藻細胞生長緩慢、倍增時間長、細胞密度低(室外培養密度最高僅為2X IO6ceIlAiL酶，產量低。合適的培養基是實現牟氏角毛藻高密度培養的重要因素之一。以前使用的培養基沒有加入碳酸氫鈉和維生素及微量元素，但大量實驗表明，牟氏角毛藻除了能利用空氣中游離的CO2，還能有效地利用培養液中的HCO3-作為碳源。添加NaHCO3不僅縮短了牟氏角毛藻的倍增時間，而且延長了藻的生長時間。我的實驗表明，添加500mg的NaHCO3和5國際單位九二 O植物生長刺激素(即赤霉素)，5Xl(T4mg VB12,0. Img VB1后，營養更加全面、均衡,能大大提高生長速度,牟氏角毛藻產量能提高87%。貝類人工苗種技術的不斷改進和工廠化種苗技術的提高，要求技術人員在生產中能夠穩定提供大量單胞藻作為餌料，為解決這個問題，國內外藻類培養工作者做了很多研究，有封閉立柱式、薄膜袋式、開放水泥池式等多種培養方法。生產上現在一般采用玻瓶一級保種，小池或小型薄膜袋或玻璃缸桶二級擴種和大池三級培養，存在很多缺點易污染、成本高、洗刷困難、操作不便、容易劃破等。我用聚乙烯白色塑料桶并充入空氣和CO2混合氣體進行牟氏角毛藻二級擴種，并取得了理想效果。CO2來源廣泛，利用CO2促進微藻細胞的生長，具有良好的經濟價值。我的研究證明，將CO2和空氣形成的混合氣體(Vas Vsn =
1 15)充入藻液，可明顯促進牟氏角毛藻的生長，生產量大大高于不充氣和只充入純空氣或純CO2的平行對照。CO2對微藻的光合作用及固碳效率的影響機理，已有廣泛的研究。用白塑料桶充氣培養方法進行牟氏角毛藻二級擴種，大小合適，易于搬動，操作靈活，不易污染，不忌直射光，可封閉式充氣，洗刷方便，可以重復使用，不易損壞，不易劃破，透光性好，成本低廉,生長快,產量高。
發明內容
為了克服目前技術的不足，本發明提供了一種牟氏角毛藻培養基配方及白塑料桶充氣培養方法，具體技術方案如下一種牟氏角毛藻培養基，配方如下co(nh2)2(即尿素)21. 5mg, KH2P048mg, FeC6H5O7 · 5H20(即檸檬酸鐵)0. 5mg, Na2SiO3 · 9H20 8mg, NaHCO3500mg，九二 0植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，VB125X10_4mg，VB1 O. lmg，海水IOOOmL0一種牟氏角毛藻培養基，其特征在于該牟氏角毛藻培養基配方如下CO(NH2)2 (尿素)21. 5mg，KH2P048mg，FeC6H5O7 · 5H20(檸檬酸鐵)0.5mg，Na2SiO3 · 9H208mg, NaHCO3 500mg,九二 O植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，VB125X 10_4mg, VB1O. lmg, VB6 O. lmg,朽1 檬酸鐵銨 lmg, ZnS04500mg,體積比 I % 的鑰酸水溶液15ml,硫酸猛5mg,磷酸二氫鉀IOmg,氯化鉀3mg,海水lOOOmL。一種牟氏角毛藻培養方法，其特征在于包括如下步驟采用白塑料桶充氣培養方法；白色塑料桶為市場售常用聚乙烯塑料桶，圓筒形，直徑30cm，高60cm，加滿水約6. 5X 104ml，消毒海水洗凈，再用蒸餾水潤洗3遍，桶口處用酒精擦洗消毒備用；白色塑料桶置于室外水泥地上，頂部有透明玻璃鋼瓦遮陰，四周開放式，將白桶放置于離地O. 5m的水泥板上，自然光照射，最佳溫度25-30°C，最佳光照強度10000-150001x,或人工光源光照，60 100瓦電燈或日光燈，需1500 3000勒克斯/厘米
2;培養用海水采用漂白液(次氯酸鈉)氧化法消毒；漂白液氧化法消毒方法是Im3海水中加入漂白液200 300mL，使海水中有效氯含量達到10 20mg/L，充氣8 12h后，用硫代硫酸鈉中和余氯；硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止。按照所述的牟氏角毛藻培養基配方添加培養基，藻種要選擇生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；充氣培養，接種密度為30X 104cell/mL，充入空氣和二氧化碳混合氣體，體積比比例為 V二氧化碳=15 1，充氣量不宜太大，以藻細胞浮起不下沉即可；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復進行；用透明薄膜蓋于桶上部，然后用橡皮筋拉緊，進行封閉式培養；經過5-7天的培養，密度達300X 104-400X 104cell/mL即可采收或轉入下一級培養。優選地，充氣培養時充入空氣和二氧化碳、臭氧混合氣體，體積比比例為Vsn : V二氧化碳·臭氧=15 · I · I。有益效果我的實驗表明，用尿素代替硝酸鈉或硝酸鉀作為培養牟氏角毛藻的氮源，并補充500mg的NaHCO3和5國際單位九二 O植物生長刺激素(即赤霉素)，5 X 10_4mg VB12,0. ImgVB1后，營養更加全面、均衡，縮短了牟氏角毛藻的倍增時間，延長了藻的生長時間，能大大提高生長速度，牟氏角毛藻產量能提高87%。用白桶并充入CO2混合氣體方法進行牟氏角毛藻二級擴種，大小合適，易于搬動，操作靈活，不易污染，不忌直射光，可封閉式充氣，洗刷方便，可以重復使用，不易損壞，不易劃破，透光性好，成本低廉，生長快，產量高。
具體實施例方式培養基配制方法I)檸檬酸鐵較難溶解，可加少量自來水在火爐上微熱至80-90°C，并不斷攪拌至全部融化；2)九二 O植物生長刺激素(即赤霉素)為白色結晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀
釋。3)加營養鹽的過程中需不斷攪水，而且各種營養鹽按配方中提供的順序加入，以免發生化學反應；4)各種營養鹽可先配成濃度較高的母液，再依次添加。5)全部營養鹽加完后再充氣攪拌15分鐘，即可接種。6)此培養基配方對牟氏角毛藻各級培養階段都適用。一種牟氏角毛藻培養基，配方如下CO (NH2) 2 (即尿素)21. 5mg, KH2P048mg,FeC6H5O7 · 5H20(即檸檬酸鐵)0. 5mg, Na2SiO3 · 9H20 8mg, NaHCO3 500mg，九二 0 植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，VB125X l(T4mg, VB1 O. lmg,海水IOOOmLo一種牟氏角毛藻培養基，其特征在于該牟氏角毛藻培養基配方如下CO (NH2) 2(尿素)21. 5mg, KH2PO4 8mg，FeC6H5O7 · 5H20(檸檬酸鐵)0. 5mg,Na2SiO3 · 9H208mg, NaHCO3 500mg,九二 0植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，VB125Xl(T4mg, VB1O. lmg, VB6 O. lmg，梓檬酸鐵銨 lmg, ZnS04500mg,體積比 I % 的鑰酸水溶液15ml,硫酸猛5mg,磷酸二氫鉀IOmg,氯化鉀3mg,海水lOOOmL。一種牟氏角毛藻培養方法，其特征在于包括如下步驟采用白塑料桶充氣培養方法；白色塑料桶為市場售常用聚乙烯塑料桶，圓筒形，直徑30cm，高60cm，加滿水約6. 5X 104ml，消毒海水洗凈，再用蒸餾水潤洗3遍，桶口處用酒精擦洗消毒備用；白色塑料桶置于室外水泥地上，頂部有透明玻璃鋼瓦遮陰，四周開放式，將白桶放置于離地O. 5m的水泥板上，自然光照射，最佳溫度25-30°C，最佳光照強度10000-150001x,或人工光源光照，60 100瓦電燈或日光燈，需1500 3000勒克斯/厘米
2;培養用海水采用漂白液(次氯酸鈉)氧化法消毒；漂白液氧化法消毒方法是Im3海水中加入漂白液200 300mL，使海水中有效氯含量達到10 20mg/L，充氣8 12h后，用硫代硫酸鈉中和余氯；硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止。按照所述的牟氏角毛藻培養基配方添加培養基，藻種要選擇生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；充氣培養，接種密度為30X 104cell/mL，充入空氣和二氧化碳混合氣體，體積比比例為 V二氧化碳=15 1，充氣量不宜太大，以藻細胞浮起不下沉即可；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復進行；用透明薄膜蓋于桶上部，然后用橡皮筋拉緊，進行封閉式培養；經過5-7天的培養，密度達300X 104-400X 104cell/mL即可采收或轉入下一級培養。優選地，充氣培養時充入空氣和二氧化碳、臭氧混合氣體，體積比比例為Vsn : V二氧化碳·臭氧=15 · I · I。最后應說明的是以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和范
圍。
權利要求
1.一種牟氏角毛藻培養基，其特征在于該牟氏角毛藻培養基配方如下CO(NH2)2(尿素)21. 5mg，KH2P048mg，FeC6H5O7 ·5Η20(檸檬酸鐵)0. 5mg，Na2SiO3 *9H208mg,NaHCO3 500mg，九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，VB125 X IO-4HigiVB1O. lmg，海水 lOOOmL。
2.如權利要求I所述的ー種牟氏角毛藻培養基，其特征在于該牟氏角毛藻培養基配方如下CO(NH2)2(尿素)21. 5mg，KH2P048mg，FeC6H5O7 ·5Η20(檸檬酸鐵)0. 5mg，Na2SiO3 *9H208mg,NaHCO3 500mg,九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，VB125 X l(T4mg，VB1O. lmg,VB6O. lmg,朽1檬酸鐵銨lmg, ZnS04500mg,體積比I %的鑰酸水溶液15ml,硫酸猛5mg,磷酸ニ氫鉀IOmg,氯化鉀3mg,海水lOOOmL。
3.一種牟氏角毛藻培養方法，其特征在于包括如下步驟 采用白塑料桶充氣培養方法；白色塑料桶為市場售常用聚こ烯塑料桶，圓筒形，直徑30cm,高60cm,加滿水約6. 5X 104ml,消毒海水洗浄，再用蒸懼水潤洗3遍,桶ロ處用酒精擦洗消毒備用；白色塑料桶置于室外水泥地上，頂部有透明玻璃鋼瓦遮陰，四周開放式，將白桶放置于離地0. 5m的水泥板上，自然光照射，最佳溫度25-30°C，最佳光照強度10000-150001x，或人工光源光照，60 100瓦電燈或日光燈，需1500 3000勒克斯/厘米2 ;培養用海水采用漂白液(次氯酸鈉)氧化法消毒；漂白液氧化法消毒方法是Im3海水中加入漂白液200 300mL，使海水中有效氯含量達到10 20mg/L，充氣8 12h后，用硫代硫酸鈉中和余氯；硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止。
按照權利要求I所述的牟氏角毛藻培養基配方添加培養基，藻種要選擇生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；充氣培養，接種密度為30 X IO4ceIΙ/mL，充入空氣和ニ氧化碳混合氣體，體積比比例為: Vニ 15 1，充氣量不宣太大，以藻細胞浮起不下沉即可；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復進行；用透明薄膜蓋于桶上部，然后用橡皮筋拉緊，進行封閉式培養；經過5-7天的培養，密度達300X 104-400X 104cell/mL即可采收或轉入下ー級培養。
4.如權利要求3-4所述的牟氏角毛藻培養方法，其特征在于包括在充氣培養時充入空氣和ニ氧化碳、臭氧混合氣體，體積比比例為Vs氣臭氧=15 : I : I。
全文摘要
本發明屬海洋微藻養殖領域，涉及一種牟氏角毛藻培養基配方及白塑料桶充氣培養方法。牟氏角毛藻是一種小型海洋硅藻，富含多不飽和脂肪酸、蛋白質等，是對蝦、鮑魚等海珍品的優質育苗餌料。目前牟氏角毛藻生產上多采用f/2培養基配方進行培養，存在問題是營養物質不均衡，不全面，生長緩慢、倍增時間長、產量低。實驗顯示，用尿素取代硝酸鹽作氮源并補充NaHCO3和植物生長刺激素、VB12、VB1后，營養更加全面、均衡，牟氏角毛藻產量能提高87％。另外，現生產中多采用水泥池或玻璃缸桶進行培養，有很多缺點易污染、洗刷困難、操作不便、易劃破。本研究表明，用白塑料桶充氣培養角毛藻，操作靈活，不易污染，洗刷方便，不易劃破，成本低，產量高，可大規模推廣。
文檔編號C12R1/89GK102851215SQ201210301019
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者王培磊 申請人:王培磊