專利名稱：激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法
技術領域：
本發明提供一種激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
小球藻(Chlorella)是一種常見的水生單細胞藻類，是綠藻小球藻科中的一個重要屬，生態分布廣泛，在海水和淡水中均有分布，目前包括大約10個種。小球藻細胞內含有豐富的蛋白質、必需氨基酸、多糖、脂類、葉綠素、胡蘿卜素和維生素等等，在保健食品、水產養殖、化妝品、醫藥等領域內應用廣泛，國內外市場供不應求。與美國、日本、以色列等國家相比，我國的小球藻工業化大規模培養水平相對滯后。蛋白核淡水小球藻是一種球形單細胞淡水藻類，通常生長在富營養化的水體中，但在人工培養條件下能大量生長繁殖。營養鹽、光照、PH值、溫度、微量元素、碳酸氫銨等因素均能影響該藻生長。目前，小球藻產業化培·養主要采用傳統的開放式戶外大池培養方式，該方式的培養生物量普遍較低，且具有生長周期長、易污染等缺點。光生物反應器培養是進行小球藻光合自養的經典途徑，但成本高、規模小等缺點也限制了其發展。化石能源的短缺和嚴重的環境污染使得可再生能源的開發變得非常迫切。微藻因易培養、含油量高和不與農爭地等優點被國內外專家視為唯一有可能完全替代化石能源的生物柴油原料。目前，利用微藻生產生物柴油成本還太高，價格上與化石能源相比沒有競爭力。獲取優良產油藻株是降低利用微藻制備生物柴油成本最關鍵和的最有效一步。激光是一種光量子流，作為一種新型基因突變誘變劑，具有能量密度高、單色性好、方向性強、操作簡單、變異率高、速度快、造價低、損傷輕、無污染、安全性強等諸多優點。我國的激光誘變育種自上世紀70年代初起步以來，在糧食作物、經濟作物、水產及微生物領域都取得了豐碩的成果。微藻是進行激光誘變的優良材料，其結構簡單、生命周期短、光敏性強、代謝過程極易受環境影響，也容易被檢測。國內有關激光對微藻的誘變效應研究起步于上世紀九十年代，僅限于螺旋藻、雨生紅球藻等少數經濟微藻，但均取得了比較理想的效果。福建師范大學莊慧如課題組從2000年開始在這方面作了一些有益的探索，利用激光對微藻進行誘變，得到的誘變株生長速率、色素、蛋白質、可溶性多糖含量等均比出發株有不同程度的提高。福建師范大學公布了一種激光-微波誘變選育富硒紫球藻變株的方法(200410039822)，涉及利用YAG激光和微波誘變結合富硒馴化，篩選富硒紫球藻變株的方法。所采用的激光、微波誘變設備簡單、操作安全、誘變效果好，在微藻藻種選育中有較大的推廣價值。目前，國內市場上已經公開了一些刺激小球藻快速生長的相關專利技術，大多數是針對培養基成分改良的。如華東理工大學公布了一種適合于普通小球藻高密度高品質培養的培養基組合物(200610024004)，所述培養基基本上由KNO3 (7 11克/升)、葡萄糖(25 35克/升)以及少量無機鹽、微量元素和水組成。該發明的培養基可使普通小球藻達到高密度培養的前提下，藻體品質與異養培養相比有較大幅度提高，培養結束時達到光自養培養時的水平。清華大學提供了一種高密度培養異養小球藻的方法(200610078003)。該方法是在通氣培養瓶中加入含葡萄糖的培養基和少許添加劑CSL，在異養條件下快速培養小球藻，該技術解決了異養小球藻對葡萄糖利用不充分的問題，從而簡化了生產工藝、降低了生產成本、有利于異養小球藻的大規模高濃度培養，缺點是小球藻收獲生物量偏低。還有一些是通過優化光生物反應器或發酵罐培養條件來實現小球藻的高密度培養。如華東理工大學提供了一種高密度高品質培養小球藻的方法(200610025618)，該培養方法包括生物反應器高密度異養培養、高密度藻液的稀釋和光自養培養三個階段。可使小球藻在較短的培養周期里細胞密度達到高密度培養的水平，還可使小球藻的品質與異養培養相比有較大幅度提高，達到了光自養培養時的水平。北京科技大學提供了一種能夠無光照異養生長的小球藻種及培養方法(200510086288)，采用無光照異養批量和發酵培養方法，可以在3 6天時間內培養出小球藻，細胞干重濃度達到20 50g / L的小球藻培養物，經過離心、干燥和壓片后可以作為人類健康食品或醫藥品。缺點是操作流程復雜，生產周期長，并涉及光生物反應器和發酵罐等儀器設備的使用。清華大學公開了一種利用異養小球藻高密度發酵生產生物柴油的方法(200810100871)。該方法是以在生物反應器中高密度發酵培養的異養小球藻為原料，主要通過高生長速率與高油脂含量藻種的篩選、直接接種至搖瓶中作為一級種子培養和轉接至發酵罐中進行二級高密度發酵培養，進行條件優化與過程控制，收集藻體后經過分離、收集并干燥、抽提藻油，再經過轉酯化反應來制備生物柴油。清華大學還同·時公開了一種從自養到異養兩步培養小球藻生產生物柴油的方法(200810112998)，該專利中除了小球藻的初步培養技術略有差別，其余生產工藝相似。此外，清華大學最近公開了一種小球藻及其培養方法和它在生物柴油生產中的應用(200910083797)，篩選到一株小球藻YJ1，主要用于構建城市污水深度處理工藝，在處理污水的同時可獲得生物柴油。上述相關促進小球藻生長和生產生物柴油的專利技術雖然先進，但均未涉及激光輻照誘變高產油微藻育種的內容，而且需要光生物反應器和發酵罐等大型專業設施，對設備要求比較高，技術工藝相對復雜，且費用高，這無疑增加了生產成本和技術推廣的難度。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有操作簡單、速度快、造價低、損傷輕、無污染、安全性強等諸多優點且能短期誘變出蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法。其具體的技術方案為一種激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法，其特征在于采用如下步驟(I)制備藻液在溫度20_25°C、光強為1800-20001x、光暗比為12h/12h，以日光燈作光源培養蛋白核淡水小球藻細胞到對數生長期，獲得將進行激光輻照誘變的藻液；(2)激光輻照誘變取20ml對數生長期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導體激光進行輻照處理0. 9-1. lmin，輻照過程中用磁力攪拌保持輻照均勻，獲得突變藻株；(3)突變藻株培養將輻照誘變后的藻液倒入裝有BGll營養鹽的50ml三角瓶內，藻液中營養鹽的終濃度為1/4倍，在2(T25°C、光強180(T20001x、光暗比為12h/12h條件下培養20天，然后將藻液轉接到300ml三角瓶內，在上述條件下繼續培養20天，再將藻液轉接到IOOOml三角瓶內，在上述條件下繼續培養26天，整個培養階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營養鹽，每天定時搖藻3次。
所述的激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法，步驟(2)中，半導體激光采用海特光電有限責任公司生產的L0S-BLD-0808-12W-C- —體化光源激光器，功率6w。所述的激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法，蛋白核淡水小球藻源自中國科學院水生生物研究所，編號為31號的藻株。本發明與現有技術相比，其優點是I、本發明簡單易行(短時間的激光輻照)、造價低、損傷輕、無污染、安全性強，原材料蛋白核淡水小球藻細胞可以按常規方法自行培養。2、本發明能誘變出顯著提高總脂含量的蛋白核淡水小球藻突變株，實驗證明，同等條件下培養66天，半導體激光輻照0. 9-1. Imin誘變組突變株與未經過激光輻照處理的出發株相比，總油脂含量提高到出發株的3. 64-3. 75倍，總油脂含量分別達到了藻細胞干·重的58. 45-59. 67%。具有作為工業化生物柴油生產用能源微藻藻種的潛力。
具體實施例方式以下實施例中蛋白核淡水小球藻均采用中國科學院水生生物研究所保存的31號蛋白核淡水小球藻，808nm半導體激光采用海特光電有限責任公司生產的L0S-BLD-0808-12W-C 一體化光源激光器，功率6w。實施例I :步驟I、制備藻液在溫度20°C、光強為18001x、光暗比為12h/12h條件下，以日光燈作光源培養蛋白核淡水小球藻細胞到對數生長期，使細胞濃度達IO8個/ ml，獲得將進行激光輻照誘變的藻液；步驟2、激光輻照誘變取20ml對數生長期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導體激光輻照處理0. 9min，輻照過程中用磁力攪拌保持輻照均勻，獲得突變藻株；步驟3、突變藻株培養將激光輻照細胞液沖洗入裝有BGll營養鹽的50ml三角瓶內，藻液中營養鹽的終濃度為1/4倍，在溫度20V、光強為18001x、光暗比為12h/12h培養條件下培養20天；然后將上述藻液轉接到300ml三角瓶內，在上述條件下繼續培養20天；再將上述藻液轉接到IOOOml三角瓶內，在上述條件下繼續培養26天。整個培養階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營養鹽，每天定時搖藻3次。測試結果在上述培養條件下培養66天后，油脂測試結果表明半導體激光輻照
0.9min誘變組與未經過激光處理的出發株相比，總油脂含量提高到出發株的3. 75倍，達到細胞干重的59. 67%。實施例2:步驟I、制備藻液在溫度23°C、光強為19001x、光暗比為12h/12h條件下，以日光燈作光源培養蛋白核淡水小球藻細胞到對數生長期，使細胞濃度達IO8個/ ml，獲得將進行激光輻照誘變的藻液；步驟2、激光輻照誘變取20ml對數生長期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導體激光輻照處理I. Omin，輻照過程中用磁力攪拌保持輻照均勻，獲得突變藻株；步驟3、突變藻株培養將激光輻照細胞液沖洗入裝有BGll營養鹽的50ml三角瓶內，藻液中營養鹽的終濃度為1/4倍，在溫度23°C、光強為19001x、光暗比為12h/12h培養條件下培養20天；然后將上述藻液轉接到300ml三角瓶內，在上述條件下繼續培養20天；再將上述藻液轉接到IOOOml三角瓶內，在上述條件下繼續培養26天。整個培養階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營養鹽，每天定時搖藻3次。測試結果在上述培養條件下培養66天后，油脂測試結果表明半導體激光輻照I. Omin誘變組與未經過激光處理的出發株相比，總油脂含量提高到出發株的3. 72倍，達到細胞干重的59. 35%。實施例3 步驟I、制備藻液在溫度25°C、光強為20001x、光暗比為12h/12h條件下，以日光燈作光源培養蛋白核淡水小球藻細胞到對數生長期，使細胞濃度達IO8個/ ml，獲得將進行激光輻照誘變的藻液；步驟2、激光輻照誘變取20ml對數生長期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導體激光輻照處理I. lmin，獲得突變藻株；·步驟3、突變藻株培養將激光輻照細胞液裝有BGll營養鹽的50ml三角瓶內，藻液中營養鹽的終濃度為1/4倍，在溫度25°C、光強為20001x、光暗比為12h/12h培養條件下培養20天；然后將上述藻液轉接到300ml三角瓶內，在上述條件下繼續培養20天；再將上述藻液轉接到IOOOml三角瓶內，在上述條件下繼續培養26天。整個培養階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營養鹽,每天定時搖藻3次。測試結果在上述培養條件下培養66天后，油脂測試結果表明半導體激光輻照I. Imin誘變組與未經過激光處理的出發株相比，總油脂含量提高到出發株的3. 64倍，達到細胞干重的58. 45%。實施例的結果測試采用以下方法，具體步驟是①將小球藻藻液轉移至50ml的離心管中，配平后，在低溫高速離心機中，于8000rpm下離心IOmin,棄去上清,應盡量棄除上清；將收集好的藻泥用于油脂含量測定；②將準備好的藻泥置于電熱恒溫鼓風干燥箱中100°C干燥過夜，分別測量各實驗組干燥粉質量Mtl,并記錄數據。研磨已稱量的干燥粉，并加入等體積的氯仿和甲醇(1:2，現配現用)在功率40W、周期lmin、破壁15s、間隔5s、3個循環的條件下進行超聲波破壁，然后將破壁完的藻液分裝于兩個50mL離心管中，配平后，于低溫高速離心機中，IOOOOrmp條件下離心IOmin ;④離心完后,取上清液,按3:1 (氯仿上清液)的比例加入氯仿并渦旋混勻。之后再加入與氯仿等體積的水渦旋混勻，靜置待其分層。取下層有機相轉入預先稱重(M1)的IOml離心管中，用氮吹儀吹干有機溶劑后稱重M2并記錄數據，氮吹儀水浴溫度設定為61°C ;⑤總脂含量的計算公式為總脂含量百分比=(M2-M1)ZMciXlOO0/^
權利要求
1.一種激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法，其特征在于采用如下步驟 (1)制備藻液在溫度20-25°C、光強為1800-20001X、光暗比為12h/12h，以日光燈作光源培養蛋白核淡水小球藻(Chlorella pyrenoidsa)細胞到對數生長期,獲得將進行激光福照誘變的藻液； (2)激光輻照誘變取20ml對數生長期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導體激光輻照O. 9-1. lmin，輻照過程中用磁力攪拌保持輻照均勻，獲得突變藻株； (3)突變藻株培養將輻照誘變后的藻液倒入裝有BGll營養鹽的50ml三角瓶內，藻液中營養鹽的終濃度為1/4倍，在20 25°C、光強180(Γ20001χ、光暗比為12h/12h條件下培養20天，然后將藻液轉接到300ml三角瓶內，在上述條件下繼續培養20天，再將藻液轉接到IOOOml三角瓶內，在上述條件下繼續培養26天，培養階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營養鹽，每天定時搖藻3次。
2.根據權利要求I所述的激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法，其特征在于步驟(2)中，半導體激光采用海特光電有限責任公司生產的L0S-BLD-0808-12W-C- 一體化光源激光器，功率6w。
3.根據權利要求I所述的激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法，其特征在于蛋白核淡水小球藻源自中國科學院水生生物研究所，編號為31號的藻株。
全文摘要
本發明提供一種激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變藻株的方法，采用如下步驟(1)以日光燈作光源培養蛋白核淡水小球藻細胞到對數生長期；(2)取20ml對數生長期藻液倒于小廣口瓶中，用半導體激光光進行輻照處理0.9-1.1min，輻照過程中用磁力攪拌，獲得突變藻株；(3)將輻照誘變后的藻液倒入裝有BG11營養鹽的50ml三角瓶內，藻液中營養鹽的終濃度為1/4倍，在20~25℃、光強1800~2000lx條件下培養20天，然后將藻液轉接到300ml三角瓶內，繼續培養20天，再將藻液轉接到1000ml三角瓶內，繼續培養26天，培養階段每7天添加一次1/4倍濃度的BG11營養鹽，每天定時搖藻3次。本發明簡單易行、成本低廉、高效。
文檔編號C12R1/89GK102787113SQ20121029660
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月12日 優先權日2012年8月12日
發明者付圣貴, 葉乃好, 孟春曉, 王元元, 蘇遠豐, 趙俞任, 高宏正, 高政權 申請人:山東理工大學